胚胎冻融对卵裂期行植入前遗传学诊断或筛查后可移植胚胎临床结局的影响

Effects of embryo cryopreservation and thawing on clinical outcomes of transplantable embryos after cleavage-stage preimplantation genetic diagnosis or screening

Biwei SHI , ^{Long CUI

,
^{Xiaoqun YE

,
^{and

Yinghui YE

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Biwei SHI

浙江大学医学院附属妇产科医院生殖内分泌科生殖遗传教育部重点实验室, 浙江杭州 310006

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浙江大学医学院附属妇产科医院生殖内分泌科生殖遗传教育部重点实验室, 浙江杭州 310006 浙江大学医学院附属妇产科医院生殖内分泌科生殖遗传教育部重点实验室, 浙江杭州 310006

Corresponding author.

叶英辉(1970-), 女, 博士, 副研究员, 硕士生导师, 主要从事生殖遗传学研究; E-mail: nc.ude.ujz@9991hyey ; nc.ude.ujz@iewibihs 第一作者：石碧炜(1981-), 男, 硕士, 主管技师, 主要从事人类辅助生殖临床及科研工作; E-mail:; n =184）与冻融胚胎组（ n =118）的移植妊娠率、着床率、活产率和流产率，并分析妊娠结局的影响因素。

结果

新鲜胚胎组正常或平衡易位胚胎检出率高于冻融胚胎组，平均移植胚胎个数多于冻融胚胎组，差异有统计学意义（均 P < 0.05）；新鲜胚胎组的妊娠率、着床率和活产率低于冻融胚胎组，而流产率高于冻融胚胎组，但差异均无统计学意义（均 P ＞0.05）。多因素logistic回归分析结果显示，女方年龄、男方年龄、胚胎类型、植入前遗传学诊断或筛查方式和病因对妊娠结局均无影响（均 P ＞0.05）。

结论

卵裂期胚胎冷冻复苏对植入前遗传学诊断或筛查后可移植胚胎的临床结局无显著影响。

Abstract

Objective

To investigate the effects of embryo cryopreservation and thawing on clinical outcomes of transplantable embryos after preimplantation genetic diagnosis (PGD) or preimplantation genetic screening (PGS) in cleavage-stage.

Methods

The clinical data of 302 cases (including 118 cases using frozen/thawing embryos and 184 cases using fresh embryos) undergoing PGD/PGS in Women's Hospital, Zhejiang University School of Medicine during January 2011 and December 2016 were retrospectively analyzed. The pregnancy rate, implantation rate, live birth rate and abortion rate of fresh and frozen-thawed embryo transfer (FET) cycles were compared. And the influencing factors for pregnancy outcome was analyzed by multivariate logistic regression.

Results

The rate of normal or balanced translocation embryos in fresh cycle was higher than that in FET cycle (23.52% vs 16.67%, P < 0.05), and the average number of transplanted embryos was more than that in FET cycle (1.54±0.56 vs 1.33±0.51, P < 0.05). But there were no significant differences in pregnancy rate (36.42% vs 40.00%, P >0.05), implantation rate (26.62% vs 32.91%, P >0.05), abortion rate (19.44% vs 8.33%, P >0.05) and live birth rate (25.96% vs 28.33%, P >0.05) between fresh cycle and FET cycle. Multivariate logistic regression showed that, parent ages, embryo status (fresh or frozen), the mode of PGD/PGS and the findings of PGD/PGS had no impact on pregnancy outcome (all P >0.05).

Conclusion

Cryopreservation do not have significant effects on the clinical outcomes of transplantable embryos after PGD/PGS in cleavage-stage.

Keywords: Cryopreservation, Embryo transfer, Fertilization in vitro , Cleavage stage, ovum, Abortion, spontaneous/etiology, Pregnancy outcome, Preimplantation diagnosis, Genetic screening

植入前遗传学诊断是对胚胎进行遗传学分析和诊断，去除有遗传缺陷的胚胎，选择诊断正常的胚胎植入子宫的一种诊断方法。而对于反复流产、反复种植失败的夫妇，可以利用植入前遗传学筛查技术选择诊断正常的胚胎移植以改善临床结局。胚胎活检是植入前遗传学诊断和筛查的主要步骤之一。人类胚胎冷冻保存技术发展至今已经极为成熟，冻融胚胎移植比新鲜胚胎移植具有更好的胚胎和子宫内膜同步性，还可有效减少中、重度卵巢过度刺激综合征的风险。然而，胚胎活检和冻融都存在胚胎损伤的风险，这两种风险因素叠加后对胚胎移植的临床结局有什么影响值得研究。本研究通过比较植入前遗传学诊断或筛查后新鲜胚胎和冻融胚胎的移植和妊娠临床结局，分析各影响因素，从而研究胚胎冻融操作对植入前遗传学诊断或筛查后胚胎发育的影响。

选取2011年1月至2016年12月在浙江大学医学院附属妇产科医院进行的卵裂期植入前遗传学诊断或筛查共302个周期，其中新鲜胚胎组184个周期，冻融胚胎组118个周期。新鲜胚胎组中，女方平均年龄为(30.3±4.3) 岁，其中＜35岁156例，≥35岁28例，男方平均年龄为(32.5±5.0) 岁；冻融胚胎组中，女方平均年龄为(30.0±4.2) 岁，其中＜35岁100例，≥35岁18例，男方平均年龄为(31.9±5.2) 岁。两组孕妇和配偶年龄差异均无统计学意义(均 P ＞0.05)。

倒置显微镜(TE2000-U)、体视镜(SMZ1500) 购自日本尼康公司；TransferMan 4r显微操作系统购自艾本德(中国)有限公司；Thermo Scientific 3111二氧化碳培养箱购自赛默飞世尔科技中国有限公司；Octax Microscience GmbH激光系统购自瑞典Vitrolife公司；ThermoBrite S500原位杂交仪购自美国雅培公司；Olympus AX70荧光显微镜购自日本Olympus公司；图像采集系统(SpectraCube Spectral imaging)购自以色列实用光谱影像公司；MALBAC-Lab PCR扩增仪购自亿康基因公司；InnoScan 710芯片扫描仪购自美国InnoScan公司、Planer Kryo 360-1.7程序冷冻仪购自英国Planer公司。

G1培养基、G2培养基、FreezeKit Cleave冷冻试剂盒和ThawKit Cleave解冻试剂盒购自瑞典Vitrolife公司；乙醇购自杭州欧拓普生物技术有限公司；1×PBS购自美国Cell Signaling Technology公司；Sure Plex扩增试剂盒、微阵列比较基因组筛查基因芯片系统24sure购自美国Illumina公司。

所有卵母细胞均行卵胞浆内单精子注射，授精16~18 h后观察受精情况，受精卵用G1培养基培养至第3天，观察分裂情况。

对正常受精并于第3天发育到6个细胞以上、卵裂球大小均匀、碎片占比20%以下的胚胎进行活检，采用激光法打孔，每个胚胎吸取一个有核的卵裂球，活检后胚胎放入G2培养基中继续培养。

卵裂球低渗处理并将细胞核固定于玻片，60 ℃烘烤。将玻片依次放入70%、80%、100%乙醇中脱水，室温晾干玻片。向标本上加相应探针，封片，于75 ℃变性5 min，37 ℃杂交过夜。洗脱玻片室温风干，加5 μL DAPI(0.2 mg/mL)复染，于暗处用荧光显微镜观察信号，照像保存。

将卵裂球经1×PBS洗涤三遍后移入预加2.5 μL 1×PBS的PCR管中。采用Sure Plex试剂盒对单细胞进行全基因组扩增。设置1×PBS+末次洗涤液作为空白对照，试剂盒中的女性基因组DNA(gDNA)稀释为6.25 pg/μL，取2.5 μL作为阳性对照。15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

采用aCGH基因芯片系统24sure，参考DNA选择Sure Ref男性DNA。待检样本和参考DNA经过荧光标记、纯化、杂交、洗涤、扫描等步骤获得扫描影像，应用BlueFuse Multi软件分析染色体组成。

单细胞经1×PBS洗涤三遍后移入预加2.5 μL 1×PBS的PCR管中。后续扩增和测序由江苏亿康基因科技有限公司完成。

采用FreezeKit Cleave试剂盒进行胚胎冷冻，采用慢速冷冻法。在室温中放入冷冻仪并启动，按以下程序冷冻：-2 ℃/min冷冻麦管至-6 ℃；保持-6 ℃并手动植冰；-0.3 ℃/min冷冻麦管至-30 ℃；-50 ℃/min冷冻麦管至-150 ℃；立即将麦管投入-196 ℃的液氮中保存。采用ThawKit Cleave解冻试剂盒进行胚胎复苏，具体步骤如下：将麦管从液氮中取出，空气中停留30 s；30 ℃水浴锅放置45 s；胚胎置于解冻液1 15 min；胚胎置于解冻液2 25 min；胚胎置于平衡液5 min；胚胎转移至培养液。胚胎解冻复苏后，成活卵裂球数≥50%，颜色明亮均一，立体感较强判定为胚胎存活。

胚胎移植后14 d测定血或尿人绒毛膜促性腺激素水平，若阳性则于停经28 d行超声检查，见孕囊及原始心管搏动诊断为临床妊娠。

着床率=孕囊数/移植胚胎数×100%；临床妊娠率=临床妊娠/移植周期数×100%；正常/平衡胚胎检出率=正常或平衡易位胚胎数/活检胚胎数×100%；流产率=流产周期数/临床妊娠周期数×100%；活产率=活产周期数/移植周期数×100%。

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差( s )表示，采用独立样本 t 检验；计数资料用百分数表示，采用 ² 检验；多因素Logistic回归分析男方年龄、女方年龄、胚胎类型、植入前遗传学诊断或筛查方式、植入前遗传学诊断或筛查病因等对妊娠结局的影响。 P ＜0.05为有统计学意义。

新鲜胚胎组正常或平衡易位胚胎检出率高于冻融胚胎组，平均移植胚胎个数多于冻融胚胎组，差异有统计学意义(均 P ＜0.05)；新鲜胚胎组妊娠率、着床率和活产率低于冻融胚胎组，而流产率高于冻融胚胎组，但差异均无统计学意义(均 P ＞0.05), 见表 1 。提示胚胎冻融对植入前遗传学诊断或筛查后可移植胚胎的临床结局无影响。表1 新鲜胚胎组与冻融胚胎组的移植和妊娠情况 Table 1 Transplantation and pregnancy in fresh embryo group and frozen thawed embryo group n )或(

正常或平衡易位胚胎

移植胚胎个数

新鲜胚胎组

23.52(199/846)

34.62(36/104)

1.54±0.56

25.63(41/160)

19.44(7/36)

25.96(27/104)

冻融胚胎组

16.67(84/504)

42.00(24/60)

1.33±0.51

32.50(26/80)

8.33(2/24)

28.33(17/60)

8.960

0.476

-2.122

1.008

1.394

0.109

＜0.01

＞0.05

＜0.05

＞0.05

＞0.05

＞0.05

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“—”：无相关数据.

302个周期中，共有164个周期进行了胚胎移植，妊娠60个周期，未妊娠104个周期。按照妊娠和未妊娠分组，两组在女方年龄、男方年龄、胚胎类型、植入前遗传学诊断或筛查方式和病因等方面差异均无统计学意义(均 P ＞0.05)，见表 2 。多因素Logistic回归分析结果进一步证明，女方年龄、男方年龄、胚胎类型、植入前遗传学诊断或筛查方式和病因对妊娠结局均无影响(均 P ＞0.05)，见表 3 。表2 植入前遗传学诊断或筛查后移植妊娠结局影响因素的单因素分析 Table 2 Univariate analysis on influencing factors of pregnancy outcome after PGD/PGS

女方年龄(岁)

男方年龄(岁)

植入前遗传学诊断或筛查方式

植入前遗传学诊断或筛查病因

29.5±4.1

31.5±5.1

30.2±4.2

32.0±5.2

-0.786

-0.732

0.801

0.871

1.431

＞0.05

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“—”：无相关数据；FISH：荧光原位杂交；aCGH：基于微阵列的比较基因组杂交；NGS：第二代测序.

表3 植入前遗传学诊断或筛查后移植妊娠结局影响因素的Logistic回归分析 Table 3 Logistic regression analysis on influencing factors of pregnancy outcome after PGD/PGS Wald 值

-0.0708

0.0659

1.156

0.932

0.819~1.060

＞0.05

0.0114

0.0532

0.046

1.011

0.911~1.123

＞0.05

0.2930

0.3420

0.731

1.340

0.685~2.621

＞0.05

植入前遗传学诊断或筛查方式

0.2620

0.3220

0.663

1.299

0.692~2.441

＞0.05

植入前遗传学诊断或筛查病因

0.1240

0.1030

1.438

1.132

0.924~1.386

＞0.05

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在植入前遗传学诊断技术出现之前，遗传病患儿出生高风险的夫妇常需经历一段心理压力很大的等待时期。一旦产前诊断确定胎儿异常，又需施行妊娠终止术，给孕妇及其家属带来生理损害和心理打击。植入前遗传学诊断技术可以使诊断时间提前到胚胎植入之前，有效地避免了患者的身心伤害。而对于高龄、反复移植失败的夫妇来说，植入前遗传学筛查的出现又是一大福音。植入前遗传学诊断或筛查的技术日新月异，从最初的卵裂期活检结合PCR以及FISH技术，到后来的aCGH及单核苷酸多态性微阵列，最近几年，NGS技术也发展迅速。应用于植入前遗传学诊断或筛查的胚胎活检是一项有创操作，需要从胚胎中获取一个卵裂球，理论上卵裂期胚胎的每一个细胞均有发育为完整个体的潜能，移出其中一个卵裂球应不影响胚胎发育，但实际上卵裂期活检可能导致胚胎发育偏慢并增加胚胎停育的风险，有研究者认为，卵裂期活检可使60%的胚胎植入潜能受到影响

胚胎冻融技术是应用于临床实践的常规项目，它可以在胚胎进行移植后有剩余的情况下或者在患者身体状态不适合移植的情况下对胚胎实现冷冻保存，并在需要时进行胚胎复苏，再次移植，从而有效减少患者促排卵次数，减轻患者身体的激素刺激和经济负担。然而，胚胎冻融也存在胚胎损伤的风险，主要是冻存保护剂的毒性、高渗透压、冰晶形成的机械损伤等。目前使用较为普遍的冷冻试剂二甲基亚砜的毒性作用需要重视，其可能与蛋白质发生作用进而影响胚胎发育潜能。冻融还会造成胚胎内部分细胞的损失，这部分损失的细胞对胚胎整体的发育潜能的影响尚有一定的争议

植入前遗传学诊断或筛查与胚胎冻融的联合使用是否会对胚胎移植及妊娠结局造成影响是值得临床关注的一个问题。本研究回顾性分析了浙江大学医学院附属妇产科医院2011年以来的资料，结果发现，在移植胚胎数略低的情况下，与新鲜胚胎组比较，冻融胚胎组的着床率、移植妊娠率、活产率未下降，流产率也未上升。正常或平衡胚胎检出率冻融胚胎组相对较低，可能与冻融胚胎组行aCGH比例较低，而行FISH比例较高有关。以妊娠结局为终点评价指标，通过多因素Logistic回归分析发现，女方年龄、男方年龄、胚胎类型、植入前遗传学诊断或筛查方式和病因均未对妊娠结局产生影响。

综上所述，植入前遗传学诊断或筛查与胚胎冻融的联合使用不会影响胚胎移植及妊娠结局，两者的联合使用具有较高的临床应用价值。首先，临床上部分患者因为卵巢功能低下导致每次只能取到几颗卵甚至仅有一颗卵，进而得到数量极少的胚胎，而进行植入前遗传学诊断或筛查需要一定的胚胎数量，以保证正常胚胎的检出。在这种情况下可以先将本周期获得的胚胎冷冻保存，等待多个取卵周期后胚胎积攒到一定数量再进行植入前遗传学诊断或筛查。其次，由于某些特殊原因(比如卵巢过度刺激综合征、患者身体不适、子宫内膜厚度不理想等)导致本周期不适合胚胎移植的情况下，可以先将植入前遗传学诊断或筛查后的可移植胚胎进行冷冻，等待患者身体状况恢复后再行胚胎复苏和移植。需要指出的是，本研究仅为单中心临床资料回顾的结果，而且样本量有限，为了得到更加充分的循证医学证据，尚有待更大样本量、多中心的随机对照实验进一步探讨。

Funding Statement

国家自然科学基金（81370761）

References

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