普朗尼克—聚乙烯亚胺纳米胶束的制备及其细胞生物学特性

Preparation, characterization and cytology study of Pluronic-PEI micelles

Hebin WANG , ^1, ² Yang LI , ² Xingang LIU , ² Jun ZHOU , ² Qingqing WANG , ² and Guping TANG ^2, ^*

Hebin WANG

1 新疆兵团南疆化工资源利用工程实验室塔里木大学生命科学学院, 新疆阿拉尔 843300 2 浙江大学化学系, 浙江杭州 310058

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Yang LI

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Qingqing WANG

2 浙江大学化学系, 浙江杭州 310058

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Guping TANG

2 浙江大学化学系, 浙江杭州 310058 1 新疆兵团南疆化工资源利用工程实验室塔里木大学生命科学学院, 新疆阿拉尔 843300 2 浙江大学化学系, 浙江杭州 310058

Corresponding author.

汤谷平(1961—)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事生物材料、药物的控制释放和基因治疗；E-mail： nc.ude.ujz@gnipuggnat ； moc.361@923nibehgnaw 第一作者：汪河滨(1980—)，男，博士，主要从事生物医用纳米材料方面的研究；E-mail：； vitro study showed that Pluronic-PEI had low cytotoxicity, and the P123-PEI600 possessed high gene transfection efficiency and could downregulate the intracellular ATP and P-gp levels.

Conclusion

Pluronic-PEI is a good drug/gene delivery system, and P123-PEI600 is an ideal vector, which may be used in the combination therapy for reversing multidrug resistance.

Keywords: Technology, pharmaceutical; Polyethyleneimine/chemical synthesis; Nanospheres; Drug carriers; Genes; Transfection; Adenosine triphosphate; P-glycoprotein; Drug resistance, neoplasm

多药耐药(multidrug resistance，MDR)是导致肿瘤化疗失败的主要原因，如何逆转MDR是肿瘤治疗的一大难题。肿瘤的多药耐药包括很多机制，如减少对药物的吸收、增加药物外排、药物代谢改变、DNA修复机制和解毒系统激活、药物诱导细胞凋亡减少等。其中由膜转运蛋白[主要包括P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP1-9)、肺耐药相关蛋白(LRP)和乳腺癌耐药蛋白(BRCP)]介导的药物外排是产生MDR最为重要的机制。目前，选择合适的药物传递系统、基因治疗和应用小分子MDR抑制剂是逆转肿瘤MDR的主要策略。近年来，药物传递系统如聚合物胶束、纳米粒和脂质体等用于克服肿瘤MDR引起科学家广泛的关注，已显示出了良好的前景。其中聚合物胶束以生物相容性好、载药量大、稳定性好、材料来源丰富和制备工艺简单而备受青睐

普朗尼克(Pluronic)是一种多功能药用辅料，由聚氧乙烯—聚氧丙烯—聚氧乙烯(PEO-PPO-PEO)三嵌段构成，当其浓度大于临界胶束浓度(critical micelle concentration，CMC)时，可自发形成胶束。其疏水内核可用于包载疏水性药物，亲水外壳具有稳定和避免网状内皮系统(reticulo-endothelial system)清除的作用。还有研究表明，某些Pluronic本身具有很好的生物活性，能够耗竭细胞内ATP，抑制P-gp的功能，影响药物外排运输，具有逆转肿瘤MDR的作用。聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)是目前研究最广泛的阳离子聚合物，具有很强的结合基因(DNA和RNA)的能力，PEI的分子量对基因转染效率起决定作用，大分子量的PEI转染效率高，但细胞毒性也较大；小分子量的PEI(分子量小于2000 u)细胞毒性低，但转染效率也低。因此，对PEI加以修饰显得尤为重要。

我们选用三种Pluronic修饰两种小分子量的PEI(PEI600、PEI1200)，并对制备的Pluronic-PEI胶束粒径大小、表面电位、CMC及绑定DNA能力、载药能力等物理化学指标进行测定，同时在细胞水平上研究其细胞毒性、转染效率及对细胞内ATP、P-gp水平的影响，以证明Pluronic-PEI胶束药物(基因)输送载体具有良好生物相容性、高转染效率。

Pluronic F127(分子量约12 600 u)、P123(分子量约5800 u)、L61(分子量约2200 u)、PEI(分子量约600 u、1200 u)、N, N′-羰基二咪唑(1, 1′-Carbonyldiimidazole，CDI，分子量约162.15 u)、三乙胺(Triethylamine，TEA，分子量约101.19 u)、芘(Pyrene，分子量约202.26 u)、98% MTT(分子量约218.1 u)、溴化乙锭(EB，分子量约394.32 u)购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司；重水(D ₂ O)购自上海百灵威化学技术有限公司；其他所有试剂均为分析纯。胰蛋白酶(Trypsin，分子量约23 300 u)购自美国西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司；1640、DMEM培养基干粉购自美国gibico公司；FBS、小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；绿色荧光蛋白质粒pEGFP购自杭州赫贝生物技术有限公司；FITC标记P-gp抗体CD44购自美国Abcam公司。质粒提取试剂盒购自德国Qiagen公司；Luciferase荧光素酶报告检测试剂盒购自美国BioVision的公司；ATP测定试剂盒、BCA蛋白测定试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司。

400 MHz核磁共振仪购自美国瓦里安公司，EA 1112元素分析仪购自意大利Eurovector公司，JEM-2010透射电镜购自日本电子光学公司，RF-5301PC荧光分光光度计购自日本岛津公司，Model 550酶标仪购自美国伯乐公司，Nikon Eclipse TE200倒置荧光显微镜购自日本尼康公司，流式细胞仪购自美国库尔特公司。

人胚肾细胞(HEK293)、非小细胞肺癌细胞(A549)、胰腺癌细胞(Panc-1) 购自中国科学院上海生科院细胞资源中心，于37 ℃、5%二氧化碳浓度的细胞培养箱中培养，取对数生长期细胞。

称取Pluronic F127(12.7 g，1.0 mmol)和CDI(0.25 g，1.5 mmol)分别溶解于20 mL二甲基亚砜(DMSO)中，混合于100 mL的圆底烧瓶中，加入TEA 0.2 mL，避光、氮气保护下搅拌反应4 h，得到F127-CDI溶液。将F127-CDI溶液缓慢滴加至PEI600(0.90 g，1.5 mmol)溶液中，滴加2 h，继续反应12 h后，溶液在水中用透析袋(截留分子量约3500 u)透析48 h，冰冻干燥，得到Pluronic-PEI产物(其他Pluronic-PEI制备方法相同)。

Pluronic-PEI的合成分为两步：① CDI活化Pluronic上的羟基，使Pluronic以酰胺键连上咪唑；② 脱去咪唑环，使PEI上的胺基与Pluronic以酰胺键相连生成Pluronic-PEI，三乙胺在这两步反应中提供一个碱性环境；反应式如图 1 所示。滴加PEI的DMSO溶液的速度要慢，并持续搅拌反应过夜得到澄清溶液。经水透析除去没有反应完的原料后冷冻干燥。

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称取5 mg待测样品，溶解于0.5 mL重水(D ₂ O)中，室温下用核磁共振仪对普朗尼克—聚乙烯亚胺结构进行质子核磁共振测定，用MestReNova软件处理。采用元素分析仪测定Pluronic-PEI产物中碳、氢、氮元素含量，计算元素百分比。

称取一定量的Pluronic-PEI材料，置于50 mL圆底烧瓶中，加入适量的乙睛，使其充分溶解，在40 ℃下减压蒸发40 min使形成一层均匀薄膜，室温下放于真空干燥器中过夜，除去残留溶剂。然后加入去离子水进行水化，超声30 min，用0.45 μm醋酸纤维素酯膜过滤，得到透明的Pluronic-PEI胶束溶液，备用。

取上述Pluronic-PEI胶束溶液，在25 ℃的条件下，使用动态光散射测定其粒径和表面电位。

吸取上述Pluronic-PEI胶束溶液10 μL轻轻滴于电镜用碳膜铜网上，放置于无尘环境中自然晾干。在透射电镜下观察样品形貌并拍照。

配制6×10 ^-6 mol/L的芘丙酮溶液，分别取1 mL加入10个10 mL的容量瓶中，待丙酮挥干后，将不同浓度的Pluronic-PEI溶液分别加入容量瓶中，定容，超声30 min，室温放置过夜后进行测定。溶液最终的芘浓度为6.0×10 ^-7 mol/L，所制备的系列Pluronic-PEI浓度分别为1.0×10 ⁰ 、1.0×10 ^-1 、1.0×10 ^-2 、1.0×10 ^-3 、1.0×10 ^-4 、1.0×10 ^-5 、1.0×10 ^-6 、1.0×10 ^-7 、1.0×10 ^-8 、1.0×10 ^-9 mg/mL。在荧光分光光度计上，固定发射波长为395 nm，测定300~350 nm处的激发光谱。采用荧光强度比值(I ₃₃₉ /I ₃₃₄ )和浓度的对数值关系计算CMC

称取琼脂糖0.5 g，加入1×TAE电泳缓冲液50 mL中，加热溶解，待冷却到约60 ℃后，加入2~3 μL溴化乙啶(EB)母液，混匀，制胶备用。按不同氮磷比将Pluronic-PEI材料溶液加到DNA(1 μg)溶液中(等体积混合)，混匀，静置0.5 h。加入上样缓冲液1 μL，进样电泳。电泳条件：1×TAE缓冲液，电压100 mV，电泳时间为30 min，在紫外灯下拍照。

分别称取100.0 mg Pluronic-PEI，置于50 mL圆底烧瓶中，加入乙腈使其充分溶解，加入5.0 mg紫杉醇，在40 ℃下旋转蒸发40 min，得到药膜骨架。然后加入去离子水溶解，超声30 min后用0.45 μm醋酸纤维素酯膜膜过滤除去不溶药物，再用去离子水透析6 h后，将溶液冷冻干燥，得到载药胶束。

采用紫外分光光度法测定胶束载药(紫杉醇)能力，在紫外分光光度计上绘制紫杉醇吸收曲线和标准曲线，结果如图 2 所示。

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根据标准曲线计算测定其载药率(drug loading)和包封率(incorporation efficiency)。计算公式如下：载药率=胶束中紫杉醇的质量/共聚物的质量×100%;包封率=胶束中紫杉醇的质量/紫杉醇的投入量×100%。

Pluronic-PEI药物释放，称取负载紫杉醇的Pluronic-PEI，在37 ℃下，以100 r/min的转速振荡，分别在pH值为7.4、5.0的PBS溶液中透析(截留分子量约3500 u)，在取样时间点取出透析外液用紫外可见分光光度计测定，计算紫杉醇的释放量，并绘制药物释放曲线。

将HEK293、A549细胞分别接种于96孔板内，每孔1×10 ⁴ 个细胞，在37 ℃，5%二氧化碳培养箱中孵育16 h。吸出培养液，加入不同浓度的Pluronic-PEI无血清培养液，孵育4 h后吸出培养液，加100 μL含有0.5 mg/mL MTT的无血清培养液，再孵育4 h，翻板、加入100 μL DMSO，振荡5 min，用酶标仪检测波长570 nm的吸光度值。按下式计算细胞存活率：细胞存活率=(经样品处理过的每孔吸光度值-空白对照的每孔吸光度值)/(未经样品处理过的每孔吸光度值-空白对照的每孔吸光度值)×100%。

将HEK293、A549细胞分别接种于24孔板内，每孔4×10 ⁴ 个细胞，在37 ℃、5%二氧化碳条件下孵育16 h后吸出培养液。将Pluronic-PEI和绿色荧光蛋白质粒pEGFP(1 μg)按照一定的氮磷比等体积混合，对照组PEI(分子量约25 000 u)与pEGFP(1 μg)按照氮磷比为10等体积混合。室温静置30 min后用无血清培养基稀释至终体积500 μL，混合均匀后加入到24孔板中，37 ℃孵育4 h后，吸出培养液，用PBS洗涤，每孔加入500 μL含10%血清的培养基继续培养48 h后，在倒置荧光显微镜下观察和拍照。

按照1.4.2的方法培养细胞孵育后吸出培养液，将Pluronic-PEI和表达荧光素酶质粒pGL-3(1 μg)按照一定的氮磷比混合，相同方法培养48 h后，吸去孔中培养基，用PBS洗涤，加入100 μL PBS在-80 ℃下反复冻融两次，按照Luciferase荧光素酶报告检测试剂盒方法检测荧光素酶活力，记录相对荧光单位(relative light unit，RLU)。蛋白浓度用BCA试剂盒检测，绘制标准曲线，计算样本中总蛋白的浓度，最后样品中荧光素酶的表达量用RLU/mg蛋白表示。

将A549细胞接种于六孔板中，每孔2×10 ⁵ 个细胞，在37 ℃、5%二氧化碳条件下孵育16 h后吸出培养液。然后每孔分别加入浓度为20、40、60、80、100 μg/mL的Pluronic-PEI溶液(无血清培养液配制)，孵育4 h。同时加入空白即无血清培养液作为阴性对照。孵育结束后，采用预冷的PBS洗涤三遍，每孔中加入400 μL 1.0%的Tritonx-100裂解细胞。采用ATP检测试剂盒在发光测量仪上测定ATP的含量。加入50 μL ATP样品和450 μL标准反应溶液，立即进行发光读数，记录20 s时的读数。扣除发光本底，将测得的发光读数代入预先制作的标准曲线中即可测得细胞样品中ATP含量。另一部分样品用BCA法测定细胞蛋白含量，将测定的ATP含量除以相应孔的蛋白含量，用以消除每孔细胞数量所带来的误差。

将Panc-1细胞接种于24孔板中，每孔密度为4×10 ⁴ 个细胞，孵育16 h后吸出培养液。然后每孔分别加入系列浓度为20、40、60、80、100 μg/mL的Pluronic-PEI溶液(无血清培养液配制)，于37 ℃孵育4 h。同时加入无血清培养液作为阴性对照。孵育结束后吸出培养液，每孔加入500 μL含10%血清的培养基继续培养24 h后，加入FITC标记的CD44抗体，5 min后用PBS洗涤，在倒置荧光显微镜下观察拍照。用无EDTA胰酶消化、离心、PBS重悬后，用流式细胞仪的FL-1通道检测绿色荧光，根据荧光强度计算细胞内P-gp的表达水平。

实验所得的数据采用Excell 2013(for Windows)统计分析软件进行统计分析，多组比较采用单因素方差分析， P < 0.05为差异有统计学意义。

核磁共振氢谱显示，δ1.0 ppm为Pluronic中-CH3的质子峰，δ 3.4~3.6 ppm为Pluronic中-CH2CH2O、-CH质子峰，PEI质子峰-NHCH ₂ -出现在δ 2.2~2.8 ppm，见图 3 。提示合成了Pluronic-PEI。根据峰的积分比例可以计算出三种Pluronic与PEI的接入比为1：1。

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Pluronic-PEI的元素分析结果显示，各化合物的元素比例与理论值相符合(结果见表 1 )，进一步证明Pluronic与PEI的接入比为1：1。表1 普朗尼克—聚乙烯亚胺元素分析结果 Table 1 Elemental analysis of Pluronic-PEI

F127-PEI600

F127-PEI1200

P123-PEI600

P123-PEI1200

L61-PEI600

L61-PEI1200

56.26

56.04

56.56

59.58

59.66

56.05

55.66

56.72

56.69

56.66

59.63

59.31

55.71

55.76

10.14

10.08

10.05

10.21

11.09

11.53

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F127、P123、F127-PEI、P123-PEI均能够通过薄膜水化形成纳米胶束，胶束呈球形，分布较为均匀，无团聚现象，而L61和L61-PEI团聚现象明显，不易形成胶束(因此后面不再研究L61-PEI)，见图 4 。动态光散射测定粒径大小结果与透射电镜结果基本一致，单纯Pluronic表面电位基本为零，接入PEI后表面电位为正，+6~+9 mV，见表 2 。

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表2 普朗尼克—聚乙烯亚胺粒径和电位分析结果 Table 2 Particle size and zeta potential of Pluronic-PEI

粒径(nm)

表面电位(mV)

81.7±1.0

-0.22±0.4

F127-PEI600

149.1±2.5

+6.16±0.9

F127-PEI1200

181.2±8.9

+8.14±0.4

30.1±0.5

-0.17±0.4

P123-PEI600

122.7±4.2

+6.49±1.1

P123-PEI1200

145.9±5.2

+8.60±2.2

1698.3±745.7

-0.83±9.9

L61-PEI600

1804.0±170.2

+7.49±7.9

L61-PEI1200

2417.9±640.2

+9.11±5.6

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通过计算得到F127、F127-PEI600、F127-PEI1200、P123、P123-PEI600、P123-PEI1200的CMC值分别为1.12×10 ^-1 、1.08×10 ^-2 、0.99×10 ^-2 、5.24×10 ^-3 、1.25×10 ^-3 、1.57×10 ^-3 mg/mL，见图 5 。可以看出F127的CMC值小于P123，Pluronic接入PEI后CMC值减小，说明PEI交联到胶束亲水表面，提高了胶束的稳定性。

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PEI600、PEI1200、F127-PEI600及F127-PEI1200在氮磷比为=2：1时，就能够完全阻滞DNA，而P123-PEI600和P123-PEI1200在氮磷比为=4：1时能够完全将DNA阻滞在上样孔内，见图 6 。实验结果表明四种Pluronic-PEI均有携载DNA的能力，具有作为基因载体的潜力。

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Pluronic F127、P123及Pluronic-PEI胶束均能包载疏水药物紫杉醇，P123的包封率和载药率比F127高，见表 3 。以P123为例，在pH值为7.4时，P123的释放速度比P123-PEI600和P123-PEI1200均快(均 P ＜0.05)，见图 7 。表明PEI能有效保护药物泄露。但在pH值为5.0时，三者释放速度基本相同( P ＞0.05)。表3 普朗尼克—聚乙烯亚胺载药率和包封率 Table 3 Drug-loaded and encapsulation efficiency of Pluronic-PEI

包封率(%)

载药率(%)

15.33±4.21

0.73±0.12

F127-PEI600

16.25±3.26

0.92±0.09

F127-PEI1200

21.21±4.07

1.01±0.23

23.73±2.28

1.13±1.22

P123-PEI600

26.46±3.23

1.26±0.78

P123-PEI1200

29.40±4.18

1.40±0.19

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与F127比较， P ＜0.05.

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对照组PEI25 000具有很强的细胞毒性，随着其浓度的增加，细胞存活率降低，在浓度为80 μg/mL时，细胞的存活率仅20%以下。F127-PEI和P123-PEI则毒性较低，浓度为80 μg/mL时细胞的存活率分别达60%、50%以上，P123-PEI的毒性稍强于F127-PEI。见图 8 。提示各种Pluronic-PEI材料细胞毒性均较低。

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以PEI25 000在氮磷比值为10时的转染作为对照，在实验所选取的氮磷比值范围内，Pluronic-PEI/DNA在40：1时细胞转染效率最高，P123-PEI的转染效果好于F127-PEI，其中P123-PEI600的转染效率最好，在HEK293和A549细胞上的转染效率与PEI25 000基本相同，在HEK293上的转染效果比A549细胞上的转染效果更好，且经过48 h的转染细胞形态正常，见图 9 。说明材料对细胞的毒性小，是一种良好的基因载体。

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同样测定Pluronic-PEI在HEK293和A549细胞上的荧光素酶质粒转染效果，结果Pluronic-PEI/pGL-3在氮磷比值为10~40时，荧光素酶的表达量逐渐升高，当氮磷比值达50时所有复合物的转染效率下降。与绿色荧光蛋白转染结果相似，P123-PEI的转染效率高于F127-PEI，其中P123-PEI600的转染效率最高，在HEK293细胞上，当氮磷比值为40时其荧光素酶表达量达1×10 ⁸ RLU/mg蛋白。与HEK293细胞比较，A549的基因转染效率较低，荧光素酶表达量仅为1×10 ⁶ RLU/mg蛋白。提示Pluronic-PEI在不同细胞转染效率不同。

F127、F127-PEI对胞内ATP和P-gp水平的影响不明显，而P123、P123-PEI对胞内ATP和P-gp水平有较大影响，随着Pluronic-PEI浓度增加, ATP和P-gp含量逐渐降低。其中P123-PEI对胞内ATP和P-gp含量的影响最为明显，当浓度达到100 μg/mL时，胞内ATP的水平下降至50%左右，P-gp的含量下降20%，见图 10 。可见，ATP含量的降低与P-gp含量的变化之间存在一定的联系，ATP的含量降低影响了P-gp的表达水平。对Panc-1细胞实验结果也证明了P123-PEI600能够下调细胞内P-gp的表达水平，见图 11 。

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本研究共合成了六种Pluronic-PEI材料，通过核磁共振氢谱和元素分析对Pluronic-PEI结构进行确认。在合成过程中为了控制产物的比例，CDI用量以1.5倍为宜，且反应在无水条件下进行。在反应物用量方面，考虑到PEI可能会产生自身交联，PEI的量应稍多于Pluronic(1.5倍)。形态学表征结果证实，F127、P123、F127-PEI及P123-PEI均能够通过薄膜水化形成纳米胶束，胶束呈球形，分布较为均匀，无团聚现象，粒径在120~180 nm之间，表面电位在+6~+9 mV之间，有利于细胞吞噬；而L61和L61-PEI团聚现象明显，不易形成胶束，这是因为L61中PPO比例大，水溶性差的缘故

CMC是判断胶束稳定性的重要指标之一。CMC测定结果表明，P123-PEI具有更低的CMC值，形成的胶束稳定性更好，这是因为P123中PPO疏水比例要大于F127，疏水基团较多、更容易形成胶束，CMC值就更小。Pluronic接入PEI后CMC值降低，说明PEI交联到胶束亲水表面，提高了胶束的稳定性。

药物的载药率和包封率是评价载药体系的两个重要指标。Pluronic-PEI胶束均能包载疏水药物紫杉醇，P123的包封率和载药率比F127高，这是因为P123中疏水部分PPO的比例较高更容易包载疏水药物之故，Pluronic-PEI的载药率比单纯Pluronic高，其原因是PEI在胶束表面形成的亲水层能有效保护药物从胶束中释放出来，使载药胶束更稳定。药物释放方面，在pH值为7.4时P123的释放要比P123-PEI600和P123-PEI600快，表明PEI能有效保护药物泄露。但在pH值为5.0时，释放速度基本相同，表明在酸性条件下PEI上的氨基发生质子化，导致链疏松药物容易释放出来

细胞学实验表明，各种Pluronic-PEI材料均具有较低的细胞毒性，其中P123-PEI的毒性要稍高于F127-PEI，这是由于P123中疏水(PPO)比例较高之故；细胞转染实验结果表明，P123-PEI600基因转染效率最高，在HEK293细胞上转染能力与PEI25 000相当。同时P123-PEI600也能使细胞ATP水平和P-gp水平下降。MDR产生的主要原因是P-gp的过表达及P-gp对药物的外排作用，外排药物时需消耗ATP，因此P123-PEI可以通过耗竭耐药细胞的ATP水平来逆转细胞耐药作用

综上所述，Pluronic-PEI是一种良好的药物和基因输送体系，其中P123-PEI600是理想的可用于逆转肿瘤多药耐药的载体，在联合治疗方面具有较大的应用前景。

Funding Statement

国家自然科学基金（51573161）

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