1. 细胞凋亡

细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式, 在维持机体发育和组织稳态中起着关键作用。细胞凋亡包括内在途径和外在途径2种不同方式。内在凋亡途径由氧化应激或DNA损伤激活, 外在凋亡途径由细胞外死亡受体信号激活 ^{[ 16 ]} 。死亡受体可以被TNF、Fas配体或TNF相关的凋亡诱导配体, 以及PRR激活。虽然内在凋亡途径和外在凋亡途径的启动信号不同, 但2种细胞凋亡途径的完成都依赖胱天蛋白酶（cysteinyl aspartate specific protease, caspase）。在细胞凋亡的过程中, 起始caspase（caspase-8和caspase-9）剪切活化下游的效应caspase（caspase-3、caspase-6和caspase-7）来执行细胞凋亡的程序。效应caspase裂解细胞内底物、产生酶促作用, 导致细胞器酶解、DNA片段化、细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸暴露从而完成细胞解体 ^{[ 17 ]} 。

机体发育过程中或组织稳态状态下, 典型的细胞凋亡是非炎症性的、大部分情况下是抗炎的, 其原因可能是细胞碎片可被迅速清除。内在凋亡途径导致caspase激活可抑制潜在的炎症反应。例如细胞凋亡过程中, 基因组DNA被切割成小片段, HMGB1可与染色质结合, 从而限制HMGB1的促炎作用 ^{[ 8 ]} 。中性粒细胞释放具有抗菌作用的活性氧和具有清除作用的蛋白酶以清除细菌和异物 ^{[ 18 ]} , 而中性粒细胞凋亡后被巨噬细胞吞噬可防止炎症的持续, 是急性炎症反应消退的关键步骤 ^{[ 19 ]} 。免疫细胞凋亡是终止炎症、启动组织修复的关键, 凋亡不足可致炎症持续；然而, 过度凋亡也可促进炎症 ^{[ 20 ]} 。一方面, 细胞死亡破坏了屏障功能、导致组织暴露于PAMP；另一方面, 如有大量凋亡细胞不能被胞葬作用（efferocytosis）迅速清除, 则细胞凋亡可能进展为伴随细胞膜破裂的细胞坏死性凋亡, 导致细胞内DAMP释放从而促进炎症反应 ^{[ 21 ]} 。

一项针对小鼠全层皮肤缺损创面的单细胞测序研究的结果显示, 在伤后48 h内, 创面处于炎症期, 树突状细胞、Fb和中性粒细胞中与凋亡相关的基因, 包括 caspase - 3 、 S100A8 和 S100A9 表达上调 ^{[ 16 ]} , 其中中性粒细胞中表达上调的凋亡相关基因最多 ^{[ 16 ]} 。同时该文作者也对人糖尿病足中的凋亡相关通路进行了分析, 与非糖尿病足创面相比, 糖尿病足创面中的单核细胞/巨噬细胞中凋亡相关基因表达增加 ^{[ 16 ]} 。另一项研究表明, 通过靶向细胞膜转运体溶质载体家族7成员11可增强小鼠糖尿病创面中树突状细胞的胞葬作用以清除凋亡细胞, 从而促进创面愈合 ^{[ 22 ]} 。这些研究提示, 糖尿病创面可能存在凋亡过度或胞葬作用不足 ^{[ 23 ]} 。通过促进胞葬作用清除糖尿病创面中过度凋亡的细胞, 可能成为调控慢性难愈合创面炎症反应的策略之一。

2. 细胞坏死性凋亡

细胞凋亡和细胞坏死性凋亡可被同样的刺激, 包括与死亡受体结合、DNA损伤和感染等触发, 但细胞凋亡的caspase信号可抑制细胞坏死性凋亡, 表明两者间具有明确区别。与经典的非炎症性凋亡不同, 细胞坏死性凋亡导致质膜的通透性增加并且高度促炎 ^{[ 21 ]} 。

目前研究得较为清楚的是TNF-α介导的细胞坏死性凋亡。TNF-α与TNF受体结合, 在胞质端招募TNF受体相关死亡结构域蛋白、受体相互作用蛋白激酶1（receptor interacting protein kinase 1, RIPK1）等, 其中RIPK1在TNF信号通路调控的细胞坏死性凋亡和炎症反应中起着核心作用。RIPK1泛素化导致核因子κB激活, 诱导产生炎症细胞因子和介质的转录反应, 引发炎症反应 ^{[ 24 ]} 。RIPK1去泛素化可使RIPK1从细胞膜上解离, 与caspase-8前体相互作用形成凋亡信号复合体, 激活caspase-8启动caspase级联反应从而导致细胞凋亡 ^{[ 25 ]} 。抑制caspase-8活性可防止RIPK1剪切, 促进RIPK1与RIPK3的相互作用, 活化混合谱系激酶结构域样蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein, MLKL）, 驱动细胞坏死性凋亡 ^{[ 26 ]} 。已有研究表明, RIPK3-MLKL轴的激活在中性粒细胞相关的免疫性疾病, 如皮肤血管炎、溃疡性结肠炎和银屑病中发挥重要作用 ^{[ 11 ]} 。而 MLKL 全身敲除会导致葡萄球菌感染小鼠的细菌感染加重、IL-1β水平升高以及持续炎症反应 ^{[ 27 ]} 。这些结果提示, 细胞坏死性凋亡影响炎症反应。然而, 细胞坏死性凋亡的程度改变是炎症反应的原因、后果或是加重因素尚不清楚。

需要注意的是, 外源性的凋亡信号分子并不总是诱导细胞死亡。事实上, 在大多数细胞中大多数时间, TNF-α引起的是产生炎症细胞因子和介质的转录反应。并且在创面愈合过程中, TNF-α诱导的炎症级联反应是创面修复所必需的。然而, TNF-α水平过高也与慢性难愈合创面的发生发展相关。例如, 小鼠糖尿病创面中的TNF-α水平较非糖尿病创面升高, 应用TNF-α抑制剂可促进糖尿病创面的愈合 ^{[ 28 ]} , 但这是否与抑制TNF-α介导的细胞坏死性凋亡相关尚不清楚。另外, 敲除巨噬细胞中的 Fas 相关死亡域蛋白和 RIPK3 造成细胞坏死性凋亡和经典凋亡减少, 导致巨噬细胞持续浸润和小鼠全层皮肤缺损创面愈合延迟 ^{[ 29 ]} , 这提示细胞坏死性凋亡不足也可造成创面愈合延迟。可见, 在慢性难愈合创面中, TNF-α介导的细胞坏死性凋亡所发挥的作用和机制仍有待进一步研究。

3. 细胞焦亡

细胞焦亡是近年来发现的一种程序性细胞死亡方式, 其发生依赖于相关促炎caspase, 其发生过程伴随炎症反应的发生。与细胞凋亡相比, 细胞焦亡发生得更快、更剧烈。细胞焦亡过程中细胞膜的破裂导致大量促炎性细胞因子以及细胞内容物释放成为DAMP, 引起炎症级联反应 ^{[ 30 ]} 。当细胞被病原体感染或感受到内源性危险信号时, PAMP与DAMP不仅通过激活PRR促进炎症介质的转录, 同时通过介导炎症小体（inflammasome）的组装而诱导细胞焦亡。一方面, caspase-1、caspase-4、caspase-5和caspase-11通过剪切焦亡蛋白家族成员D使其活化造成细胞膜穿孔, 导致细胞渗透压变化、细胞膜破裂和细胞内容物释放, 引发细胞焦亡, 产生炎症；另一方面, caspase-1切割IL-1β前体和IL-18前体, 形成成熟的IL-1β和IL-18释放到细胞外放大炎症反应 ^{[ 30 ]} 。

在人类皮肤中表达水平最高的炎症小体是核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白1（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 1, NLRP1） ^{[ 31 ]} , 该炎症小体主要分布在分化的上皮细胞如KC中 ^{[ 32 ]} 。NLRP1炎症小体可由细菌配体胞壁酰二肽、炭疽致死毒素以及依赖于细胞内ATP耗竭的紫外线照射触发 ^{[ 32 ]} 。有趣的是, 虽然KC耐受caspase-1激活的细胞焦亡, 但紫外线照射下人KC中NLRP1炎症小体的形成反而会促进caspase-1介导的细胞焦亡 ^{[ 32 ]} 。到目前为止, 在慢性难愈合创面中, 炎症小体的激活已有报道 ^{[ 10 ]} , 但细胞焦亡的发生尚未被直接证实, 还有待进一步研究。

4. NETosis

NETosis是一种主要发生在中性粒细胞中的细胞死亡类型, 其发生过程为中性粒细胞活化, 向细胞外释放解聚的染色质和细胞内颗粒蛋白形成NET ^{[ 33 ]} 。NET通过捕获和杀死病原体, 发挥有益的抗菌活性 ^{[ 34 ]} 。然而, NETosis发生时伴随着细胞膜穿孔, 细胞膜一旦破裂就会释放DAMP和其他炎症介质, 从而加重炎症反应, 引起组织损伤 ^{[ 33 ]} 。

研究表明, 在小鼠糖尿病创面中, NETosis的上调会加重炎症并延迟创面愈合 ^{[ 35 ]} 。另一项研究表明, 糖尿病患者的中性粒细胞中肽酰基精氨酸脱亚氨酶4（peptidylarginine deiminase 4, PAD4）表达水平升高, 糖尿病创面中NETosis增加 ^{[ 36 ]} 。通过敲除 Padi4 （小鼠中的PAD4由 Padi4 编码）可抑制NETosis从而促进小鼠糖尿病创面愈合 ^{[ 36 ]} 。有研究者认为, 应用小分子化合物抑制人或其他动物的糖尿病创面中的中性粒细胞发生NETosis, 可能成为促进创面愈合的手段 ^{[ 36 ]} 。

5. 细胞铁死亡

细胞铁死亡是近年来发现的一种新的促炎死亡方式, 由铁依赖的脂质过氧化反应触发, 该反应产生的脂质过氧化物在质膜上累积增多, 导致质膜的脂质双分子层破裂和细胞内容物的释放 ^{[ 37 ]} 。细胞铁死亡过程涉及细胞内氧化和抗氧化系统 ^{[ 38 ]} , 以及氨基酸、脂肪酸、糖等多种代谢途径及铁稳态的调控 ^{[ 37 , 39 ]} 。

除了细胞膜破裂的形态学特征、脂质过氧化和细胞内铁离子增加的生物化学特征外, 细胞铁死亡的免疫学特征也逐渐受到关注 ^{[ 37 ]} 。大量证据表明, 细胞铁死亡通过调控免疫反应影响炎症性疾病的发生发展 ^{[ 13 , 40 ]} 。首先, 细胞铁死亡可以导致不同亚群的白细胞死亡和相应的免疫功能丧失。不同极化状态下的巨噬细胞对铁死亡耐受性显著不同, 替代激活的巨噬细胞（M2型）较经典激活的巨噬细胞（M1型）对铁死亡的敏感性显著增加, 其机制是M1型巨噬细胞产生一氧化氮介导脱氧亚麻酸15-脂氧合酶活性丧失, 减少脂质过氧化物的形成, 从而耐受铁死亡 ^{[ 41 ]} 。脂质过氧化引起的T细胞铁死亡促进小鼠的病毒或寄生虫感染 ^{[ 42 ]} 。在大鼠类风湿性关节炎组织中, 花生四烯酸代谢通过脂氧合酶和环氧合酶途径导致炎症介质的释放, 并调控免疫细胞的分化 ^{[ 43 ]} 。细胞内铁过载也可促进炎症, 例如可促进巨噬细胞向促炎性巨噬细胞转化 ^{[ 44 ]} 。其次, 非免疫细胞发生铁死亡产生死亡细胞或细胞碎片, 作为DAMP被免疫细胞识别会产生炎症反应 ^{[ 43 ]} 。可见, 细胞铁死亡可通过多种机制调控炎症反应。

慢性难愈合创面多位于下肢或长期受压部位, 这些部位的静脉压力增加致红细胞渗漏, 红细胞经巨噬细胞吞噬后产生过多铁离子, 过量铁离子通过芬顿反应导致巨噬细胞持续产生大量活性氧 ^{[ 45 ]} 。该研究结果提示, 细胞铁死亡可能参与慢性难愈合创面的发生发展。在小鼠糖尿病创面应用铁死亡抑制剂铁抑素-1、在大鼠糖尿病创面应用铁螯合剂去铁胺都可通过抑制炎症反应促进创面的愈合 ^{[ 14 , 46 ]} 。然而, 慢性难愈合创面中发生铁死亡的具体细胞类型、作用及其具体机制, 以及是否可通过干预细胞铁死亡调控慢性难愈合创面炎症反应, 都有待进一步研究。

6. 结论和展望

总的来说, 有关细胞凋亡及胞葬作用、NETosis在慢性难愈合创面中作用的研究相对较多, 通过促进胞葬作用清除凋亡细胞、抑制NETosis或清除NET可调控炎症反应改善慢性难愈合创面的作用较明确。其他如细胞坏死性凋亡、细胞焦亡、细胞铁死亡在慢性难愈合创面中的作用的相关研究较少, 有待进一步探索。

一些新的细胞死亡方式的发现以及对程序性细胞死亡机制的深入研究, 加深了人们对慢性炎症的认识。有研究者提出了一些针对慢性难愈合创面有作用的干预靶点, 例如针对死亡受体干预细胞凋亡, 针对RIPK1、RIPK3和MLKL干预细胞坏死性凋亡, 以及针对焦亡蛋白家族成员D干预细胞焦亡 ^{[ 11 ]} 。但值得注意的是, 慢性难愈合创面中的炎症与一些自身免疫产生的无菌性炎症具有显著的不同, 即在创面中皮肤屏障的失去导致创面无法避免地存在病原体和PAMP。虽然细胞坏死性凋亡、细胞焦亡、细胞铁死亡等被认为是促炎的程序性细胞死亡方式, 但抵御病原体感染、启动愈合的炎症反应也是组织恢复稳态、完成修复所必需的。对于慢性难愈合创面中各种程序性细胞死亡方式及其发生时释放的DAMP的作用, 仍有待深入和精确地探讨。在体内外干预各种细胞死亡通路上直接的调控蛋白 ^{[ 29 ]} , 观察程序性细胞死亡方式变化及产生DAMP的差异, 以及最终对慢性难愈合创面愈合的影响, 可能为慢性难愈合创面的发病机制研究和治疗提供参考。

Funding Statement

国家自然科学基金面上项目（82072262、82072173）；国家自然科学基金青年科学基金项目（82302796）

General Program of National Natural Science Foundation of China (82072262, 82072173); Youth Science Fund Program of National Natural Science Foundation of China (82302796)