水稻材料H447为籼稻恢复系R819与优质米常规籼稻品种玉针香杂交后, 以R819为轮回亲本回交、自交得到的BC ₃ F ₆ 代品系。该品系具有抗稻瘟病、株型紧凑、米质优等特点。Cas9载体pYLCRISPR/ Cas9-MT(I)及gRNA载体pYL-U3/U6a-b-gRNAs ( 图1 )由华南农业大学刘耀光研究员馈赠。

图1

Fig. 1

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	图1 YLCRISPR/Cas9-MT(I)及pYL-U3/U6a-b-gRNA质粒图 Fig. 1 Maps of YLCRISPR/Cas9-MT(I) and pYL-U3/U6a-b-gRNA vectors

根据调控水稻 TGW6 的外显子序列(GenBank登录号为AB513135.1), 设计 TGW6 的gRNA。按A/G(N) 20NGG序列设计20 nt的寡核苷酸gRNA核心序列, 在水稻基因组数据库中比对设计好的gRNA序列以排除非特异性的靶切位点。寡核苷酸序列见 表1 。同时设计CRISPR鉴定引物Cas9-TGW6testF: 5° -CAAC CAAACCAAAGCCTGC-3° 和Cas9-TGW6testR: 5° -C CAATGCCTCATCAACTTAC-3° 。所有寡核苷酸链引物均由Thermo Fisher Scientific公司合成。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 gRNA靶点以及寡核苷酸序列 Table 1 Target sites of the gRNA and the oligonucleotide sequences 引导RNA gRNA 寡核苷酸序列 Oligonucleotide sequence (5° -3° ) TGW6U3-T1-F ggcaGCCAGCATCTGGACCTCGG TGW6U3-T1-R aaacCCGAGGTCCAGATGCTGGC TGW6U6a-T2-F gccGGCTACAGCCATGAGAAGCA TGW6U6a-T2-R aaacTGCTTCTCATGGCTGTAGC TGW6U6b-T3-F gttgAGGCAAGCGGCGACCGCGG TGW6U6b-T3-R aaacCCGCGGTCGCCGCTTGCCT

表1 gRNA靶点以及寡核苷酸序列 Table 1 Target sites of the gRNA and the oligonucleotide sequences

参照Ma等 ^{[ 18 ]} 的方法略作修改。(1)制备双链接头。分别取等量每个靶点的1对gRNA寡核苷酸链的上游引物与下游引物混合(终浓度1 µ mol L ^-1 ), 95℃处理30 s, 然后移至室温冷却完成退火; (2)酶切。取pYL-U3-gRNA、pYL-U6a-gRNA及pYL-U6b-gRNA质粒各1 μ g, 制备20 μ L反应体系, 用5~10 U Bsa I (NEB)酶切20 min, 70℃处理10 min使酶失活; (3)连接和PCR扩增: 分别将酶切过的pYL-U3-gRNA、pYL-U6a-gRNA及pYL-U6b-gRNA质粒与各自所对应双链接头连接, 然后分别利用引物B1’ /B2 (B1’ : 5° -TTCAGAGGTCTCTCTCGCACTGGAATCGGCA GCAAAGG-3° ; B2: 5° -AGCGTGGGTCTCGTCAGG GTCCATCCACTCCAAGCTC-3° )、B2’ /B3 (B2’ : 5° - TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3° ; B3: 5° -AGCGTGGTCTCGTCTTGGTC CATCCACTCCAAGCTC-3° )、B3’ /BL (B3’ : 5° -TTCA GAGGTCTCTAAGACACTGGAATCGGCAGCAAA GG-3° ; BL: 5° -AGCGTGGGTCTCGACCGGGTCCA TCCACTCCAAGCTC-3° )对gDNA (gRNA对应的DNA序列)进行扩增, 先95℃ 1 min, 然后按95℃ 15 s、60℃ 15 s和68℃ 30 s进行30个循环的反应; (4)产物纯化、酶切和连接。将所有靶点gDNA PCR产物回收混合后用20 U Bsa I在37℃酶切30 min, 然后75℃处理5 min; 将酶切片段纯化后与 Bsa I酶切回收的pYLCRISPR/Cas9-MT(I)载体片段利用T4 DNA ligase (NEB) 20℃连接2 h; (5)转化及质粒测序。连接产物转化DH5α 感受态细胞后, 挑取单克隆接种培养, 抽提质粒后利用 Asc I进行酶切鉴定, 并挑取酶切( Asc I)验证正确的克隆送Thermo Fisher Scientific公司测序。

参照Hiei等 ^{[ 20 ]} 的方法, 将构建好的三靶点pYLCRISPR/Cas9-tgw6-gRNA载体通过电击转化到农杆菌EHA105中, 将PCR检测呈阳性的克隆用于水稻愈伤组织转化。

采用CTAB法提取转基因水稻基因组DNA ^{[ 21 ]} 。PCR扩增体系含2.5 μ L 10× buffer for KOD-Plus、0.5 μ L KOD plus聚合酶(5 U μ L ^-1 )、1 μ L 25 mmol L ^-1 MgSO ₄ 、2.5 μ L 2 mmol L ^-1 dNTPs、各0.5 μ L引物(10 μ mol L ^-1 , Cas9-TGW6testF与Cas9-TGW6testR)、0.5 μ L模板DNA, 以超纯水补至25 μ L。反应条件为94℃ 3 min; 32个循环的94℃ 30 s、55℃ 30 s和68℃ 60 s的反应, 最后68℃延伸5 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳(电泳缓冲液1× TAE), BIORAD凝胶成像系统观察、照相, 并送Thermo Fisher Scientific公司测序, 每个样品测序2次。

将PCR测序鉴定为突变的T ₀ 代转基因单株自交结实后得到T ₁ 代种子。T ₁ 代种子播种成苗后提取叶片基因组DNA进行PCR检测, 对经鉴定 tgw6 发生了纯合突变的个体进一步利用引物hptF: 5° -AAGCTG CATCATCGAAATTGC-3° 与hptR: 5° -AAGAATCTC GTGCTTTCAGCTTCG-3° 进行PCR检测以获得不含T-DNA成分的纯合 tgw6 突变株系。

采用随机区组设计种植不含T-DNA成分的纯合 tgw6 突变株系及H447, 2个重复, 各小区中每个株系种植6行, 每行6株。株行距为20 cm × 20 cm, 单本栽插。按大田常规栽培要求实施田间管理(水、肥、病虫害防治等)。收获成熟种子烘干后从中随机数取饱满、无病种子1000粒, 称重(g), 2个重复。保证重复间的差数与平均数之比< 5%。采用SPSS13.0计算平均值和标准误, 采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)及Duncan法多重比较, 差异显著性水平为 P ≤ 0.05。

为利用CRISPR/Cas9技术获得 tgw6 的突变体, 根据CRISPR/Cas9技术的原理, 利用载体pYLCRISPR/Cas9-MT(I)及pYL-U3/U6a-b-gRNA构建基因编辑载体。设计了3个靶点以定点编辑千粒重基因 TGW6 ( 表1 ), 分别从起始密码子附近开始设计这3个靶点( 图2 -A), 以保证可以彻底破坏 TGW6 的功能, 然后利用Golden gate的克隆方法 ^{[ 18 ]} 将这3个靶点gRNA组装到pYLCRISPR/Cas9-MT(I)载体上( 图2 -B)。

图2

Fig. 2

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	图2 gRNA靶位点及CRISPR/Cas9-gRNA的组装示意图 A: 3个靶点分别在 TGW6 基因内的位置; B: 3个靶点组装到pYLCRISPR/Cas9-MT(I)载体而成的T-DNA元件。 Fig. 2 Target sites of the gRNA and cloning of gRNA cassette into the CRISPR/Cas9 vector A: positions of three targets in the TGW6 gene locus; B: T-DNA fragment assembled with the three targets and the pYLCRISPR/Cas9-MT(I) vector.

将构建的三靶点pYLCRISPR/Cas9-tgw6-gRNA载体利用 Asc I酶切, 如 图3 所示, 3个靶点gDNA序列能被同时切出(1.8 kb左右), 表明三靶点gRNA元件顺利插入到pYLCRISPR/Cas9-MT(I)载体上。为进一步确定靶位点的准确性, 利用引物U3s (5° -GCATG GATCTTGGAGGAATCAGA-3° )、U6as (5° -GGCTA TCGAGATGCCATACA-3° )及U6bs (5° -AGAGAAGC CTAGTGTGCTCT-3° )分别对各个靶点(Target 1~3)测序分析。结果表明( 图4 ), 通过 Bsa I位点组装的3个靶点序列都与所设计靶点序列( 表1 )一致, 因此所构建的pYLCRISPR/Cas9-tgw6-gRNA载体适宜于下一步农杆菌介导的水稻遗传转化。

图3

Fig. 3

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	图3 Asc I酶切鉴定pYLCRISPR/Cas9-tgw6-gRNA载体 Fig. 3 Identification of the pYLCRISPR/Cas9-tgw6-gRNA plasmid digested with Asc I M: 1 kb DNA ladder marker; 1: pYLCRISPR/Cas9-tgw6-gRNA.

图4

Fig. 4

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	图4 3个靶点序列的测序结果 Fig. 4 Sequencing results for the three target sequences

采用CTAB法提取T ₀ 代再生水稻植株的叶片, 对潮霉素基因检测为阳性的植株利用引物Cas9- TGW6testF及Cas9-TGW6testR对 tgw6 编辑位点上下游200 bp左右区域DNA片段进行PCR扩增。电泳结果( 图5 -A)表明, 扩增产物中多为 tgw6 片段缺失纯合体, 也有部分双等位杂合突变体存在。进一步对扩增产物的测序分析表明( 图5 -B), tgw6 突变频率高达90%, 其中51%为片段缺失纯合体(缺失片段长度均在100 bp以上), 39.5%是双等位杂合突变体。

图5

Fig. 5

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图5 tgw6 突变体的PCR检测及其与野生型序列比对分析 A: T 0 代(1~22)水稻 tgw6 编辑位点附近DNA片段的PCR检测结果, 野生型(WT)为H447, 水稻扩增长度为953 bp; B: 对应于A的PCR产物的测得序列与野生型(WT)的序列比对结果。“ Frequency” 指A电泳图对应的突变体中同一类型编辑位点突变个体出现的频率。 Fig. 5 PCR identification and sequence alignment of tgw6 mutants compared to the WT line A: PCR identification results for the DNA fragments near the edited locus of the tgw6 T 0 mutants (1-22) and WT line (H447); B: sequence alignment of tgw6 mutants compared to the WT line. “ Frequency” refers to the frequency of the same edited mutation among the corresponding mutants in the electrophoresis map of A.

为进一步获得无T-DNA插入元件的 tgw6 突变体, 将T ₁ 代 tgw6 缺失纯合突变的种子播种成苗, 苗期利用引物hphF与hphR对潮霉素基因进行PCR检测。结果表明, T ₁ 代转基因苗中潮霉素基因的分离符合孟德尔定律(数据未列出), 图6 中列出了对部分 tgw6 突变体潮霉素基因PCR检测的结果, 以进一步对这些材料进行千粒重性状的分析。对T ₂ 代种子千粒重调查结果表明( 表2 ), 所分析的5种类型的纯合缺失突变都显著提高了水稻的千粒重(大于5%)。

图6

Fig. 6

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	图6 部分 tgw6 突变体潮霉素基因的PCR检测 1: WT; 2~5: 缺失103 bp的突变体; 6~9: 缺失123 bp的突变体; 10~13: 缺失141 bp的突变体; 14~17: 缺失144 bp的突变体; 18~21: 缺失148 bp的突变体。 Fig. 6 PCR identification for hph gene of parts of tgw6 mutants 1: WT; 2-5: the 103-bp deletion-mutants; 6-9: the 123-bp deletion-mutants; 10-13: the 141-bp deletion-mutants; 14-17: the 144-bp deletion-mutants; 18-21: the 148-bp deletion-mutants.

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同类型 tgw6 缺失突变体的千粒重测定结果 Table 2 Thousand grain weight of different types of homozygous deletion mutants of tgw6 突变类型 Mutant type 缺失碱基数 Base deletion (bp) 千粒重 Thousand-grain weight (g) 增加比例 Percentage increased (%) 野生型Wide type 0 22.0± 0.50 a 0 1 103 23.1± 0.57 b 5.0 2 123 23.4± 0.50 b 6.3 3 141 23.1± 0.47 b 5.0 4 144 23.7± 0.38 b 7.7 5 148 24.0± 0.35 b 8.2 Data listed in the table are mean± standard error; values followed by the same letter within the same column are not significantly different at the 0.05 probability level (Duncan’ s method). 表中所列数据为平均值± 标准误; 表中同列数据后字母相同者表示在0.05水平上差异不显著(Duncan’ s法)

表2 不同类型 tgw6 缺失突变体的千粒重测定结果 Table 2 Thousand grain weight of different types of homozygous deletion mutants of tgw6