五类栽培白芷与兴安白芷的挥发油成分及其化学亲缘关系
Analysis of volatile constituents and chemical relationship of cultivated and wild Angelica dahurica
田 恩伟 (Enwei TIAN), 成 欣 (Xin CHENG), [...], and 晁 志 (Zhi CHAO)
Abstract
目的
测定5类栽培白芷及野生兴安白芷（根）的挥发油成分及含量并分析各类白芷间的化学亲缘关系。
方法
水蒸气蒸馏法提取6类白芷挥发油，采用GC-MS法对其组分分离及鉴定，采用面积归一化法计算各组分相对含量，并对挥发油成分进行聚类分析和主成分分析。
结果
5类栽培白芷（川白芷、杭白芷、祁白芷、禹白芷、毫白芷）和野生兴安白芷共鉴定出81种化合物，分别鉴定出27、34、24、32、28、34种。主要为烷烃类、烯烃类、酯类、有机酸类、醇类等五大类化合物。壬基环丙烷、环十二烷和正十六酸分别为各类白芷共有成分中相对含量最高的挥发油成分。化学聚类结果显示：兴安白芷与5类栽培白芷形成2个分支，栽培白芷又可分为2小类，即川白芷、禹白芷、杭白芷聚为1小类，祁白芷和亳白芷聚为另1小类。主成分分析结果与聚类结果基本一致。
结论
六类白芷的挥发油组份及其含量存在一定差异，壬基环丙烷、环十二烷和正十六酸在各类白芷中含量较高。六类白芷总体上分为野生与栽培2大类。
Abstract
Objective
To determine the volatile constituents and their contents in the roots of 5 cultivated Angelica dahurica and one wild A. dahurica and analyze the chemical relationship among the plants of A. dahurica .
Methods
The essential oil was extracted from the roots of 5 cultivated plants of Angelica dahurica and one wild A. dahurica by water steam distillation. Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) was used to separate and identify all the volatile oil components in the extracts, and their relative contents were calculated with area normalization method. We also conducted clustering analysis and principal component analysis of the volatile oil components.
Results
We identified a total of 81 compounds from the roots of the 6 plants of Angelica dahurica , including 27 in Chuanbaizhi ( Angelica dahurica cv. 'Hangbaizhi'), 34 in Hangbaizhi ( Angelica dahurica cv. 'Hangbaizhi'), 24 in Qibaizhi ( Angelica dahurica cv. 'Qibaizhi'), 32 in Yubaizhi ( Angelica dahurica cv.'Qibaizhi'), 28 in Bobahizhi ( Angelica dahurica cv.'Qibaizhi'), and 34 in Xinganbaizhi ( Angelica dahuirca ). These compounds included, in the order of their relative contents (from high to low), alkanes, olefins, esters, organic acids and alcohols. Among the common components found in the roots of all the plants of A. dahurica , nonylcyclopropane, cyclododecane and hexadecanoic acid were identified as the volatile oil components that showed the highest relative contents. Clustering analysis of the volatile oil components showed that wild Angelica dahurica (Xing'anbaizhi) and the 5 cultivated Angelica dahurica (Chuanbaizhi, Hangbaizhi, Qibaizhi, Yubaizhi, Bobaizhi) could be divided into two groups, and the cultivated Angelica dahurica could be divided into two subgroups: Chuanbaizhi, Yubaizhi and Hangbahizhi were clustered in one subgroup, and Qibaizhi and Bobaizhi in another. The results of principal component analysis was consistent with those of clustering analysis.
Conclusion
The main volatile oil components and their contents vary among the 6 plants of A. dahurica . Nonylcyclopropane, cyclododecane and hexadecanoic acid are the most abundant volatile oil components in all the plants of A. dahurica , which can be divided into two clusters.
《中国药典》（2020版）规定白芷来源于伞形科植物白芷 Angelica dahurica （Fisch. ex Hoffm.）Benth. et Hook.f. ex Franch. et Sav.或杭白芷 Angelica dahurica （Fisch. ex Hoffm.）Benth.et Hook. f. var. formosana （Boiss.）Shan et Yuan的干燥根，具有解表散寒，祛风止痛，通鼻窍，燥湿止带，消肿排脓之功效 [ 1 ] 。现代所用的白芷均为栽培品，包括川白芷、杭白芷、祁白芷、禹白芷、亳白芷5类 [ 2 , 3 ] 。《中国植物志》认为川白芷和杭白芷来源于栽培变种 Angelica dahurica cv. ‘Hangbaizhi’，祁白芷、禹白芷、亳白芷来源于 Angelica dahurica cv. ‘Qibaizhi’ [ 4 , 5 ] 。
白芷的主要有效成分为香豆素类和挥发油成分 [ 6 - 8 ] 。现代药理研究表明，白芷挥发油具有抗氧化、抗过敏和镇痛、抗惊厥等活性 [ 9 - 12 ] 。近年来，关于白芷挥发油的研究主要集中于提取工艺或对某些单一品种成分及含量的测定等 [ 13 - 16 ] 。白芷品种繁多，传统认为杭白芷及川白芷品质好，质量佳 [ 17 ] ，祁、禹白芷次之，以往多对某一两个品种开展研究，很难从整体上揭示白芷挥发油成分组成以及不同来源的白芷化学成分异同。此外，各类栽培白芷及野生兴安白芷（ Angelica dahurica Benth.et Hook.）亲缘关系一直存在争议 [ 18 ] 。然而，从化学亲缘关系角度阐释此问题至今尚未见报道。因此, 本研究采用GC-MS技术对5类栽培白芷及野生兴安白芷的挥发油成分及含量进行测定，并开展各类白芷化学亲缘关系分析，以期为厘清各类白芷间的亲缘关系及其综合开发利用、药材质量控制提供科学依据。
1. 材料和方法
1.1. 供试药材
川白芷和杭白芷分别采自于四川仪陇、浙江杭州，来源于伞形科植物杭白芷 Angelica dahurica cv. ‘Hangbaizhi’的干燥根。祁白芷、禹白芷、亳白芷分别采自于河北安国、河南禹州和安徽亳州，来源于伞形科植物祁白芷 Angelica dahurica cv.‘Qibaizhi’的干燥根。兴安白芷（ Angelica dahurica ）采集于北京门头沟（ 表 1 ）。上述供试样品均由南方医科大学中医药学院田恩伟副教授于各产区采集并鉴定。所有材料（根）均在同年采收期收集（川、杭白芷采收期为一般为6月中下旬，祁、禹、亳白芷及兴安白芷采收期为8~9月），自然风干，保存于南方医科大学中医药学院标本馆。
六类白芷采集信息
1.2. 仪器与设备
HP6890/5973气相色谱质谱联用仪（Agilent）；DBWAX毛细石英管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）（Agilent）；GD-2型冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；-86 ℃超低温冰箱（北京天地精仪科技有限公司）；HPMSD化学工作站（NIST11L标准质谱图谱库和WILEY275L质谱图谱库）。
1.3. 挥发油的提取
采用《中国药典》2015年版第四部挥发油测定法提取6类白芷的挥发油 [ 19 ] 。所得挥发油用乙酸乙酯溶解并由离心管转移至进样瓶，密封，于-20 ℃保存。
1.4. GC-MS条件
GC条件：分析柱为DB-WAX毛细石英管柱（30 m× 250 μm×0.25 μm）；载气为He，载气为恒流模式，进样口温度200 ℃，手动进样，进样量为1.0 μL，进样口为分流模式，分流比5∶1；柱初始温度60 ℃，保持2 min，以5 ℃/min的速度升至110 ℃，然后以1 ℃/min的速度升至122 ℃，保持1 min，再以2 ℃/min的速度升至180 ℃，保持维持1 min，最后以4 ℃/min的速度升至210 ℃，保持10 min，共计72.5 min。
MS条件：EI电离，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，扫描质量范围m/z：30-550，溶剂延迟时间4.5 min。
1.5. 六类白芷挥发油组分和含量及化学成分聚类分析及主成分分析
利用HPMSD化学工作站检索NIST11L标准质谱图谱和WILEY275L质谱图谱，并进行人工解析，按照各色谱峰的质谱碎片图与相关文献报道进行核对，确定6类白芷挥发油成分。对总离子色谱图进行积分，采用峰面积归一化法计算6类白芷挥发油各组份的相对含量。将6类白芷挥发油化学成分导入SPSS20软件，采用Average Linkage聚类方法进行6类白芷化学亲缘关系分析，同时用Clustvis在线软件（https://biit.cs.ut.ee/clustvis/）采用奇异值分解法（SVD）对6类白芷的挥发油成分进行主成分分析（PCA）。
2. 结果
2.1. 六类白芷挥发油组分及含量分析
从6类白芷挥发油总离子流（TIC）色谱图可以看出，共分离得到111种挥发油成分（ 图 1 ），其中鉴定出81挥发油成分，川白芷、杭白芷、祁白芷、禹白芷、亳白芷、兴安白芷分别鉴定出了27、34、24、32、28、34种，挥发油含量分别占6类白芷挥发油总量的98.995%、99.292%、95.557%、99.623%、96.131%、97.229%。就单一成分而言，川白芷、杭白芷、禹白芷中相对含量最高的成分均为壬基环丙烷和环十二烷，其含量在3类白芷中分别为56.34% 和23.13%、15.92% 和11.13%、42.35% 和24.16%。祁白芷中相对含量最高的为正十六酸（20.47%）和环十二烷（19.09%），亳白芷中相对含量最高的为正十六酸（24.24%）。环十二烷为川白芷、杭白芷、祁白芷、禹白芷四者共有成分，壬基环丙烷为川白芷、杭白芷、禹白芷三者共有成分，正十六酸为祁白芷和亳白芷二者共有成分。兴安白芷中相对含量较高的为大根香叶烯B（13.13%）和环十五内酯（9.84%），大根香叶烯B虽为兴安白芷与其他栽培白芷的共有成分，但其在兴安白芷中的含量明显高于其他栽培白芷（ 表 2 ）。
白芷挥发油总离子流图
六类白芷挥发油成分组成及相对含量
按挥发油大类成分划分，6类白芷中含量（平均相对含量）较高的5个大类化合物依次为烷烃类（34.291%）、烯烃类（19.612%）、酯类（17.105%）、有机酸类（15.628%）、醇类（8.499%）。5类栽培白芷的烷烃类化合物含量明显高于野生兴安白芷（3.881%），其中以川白芷（79.471%）和禹白芷（66.512%）烷烃化合物相对含量最高。而烯烃类化合物以兴安白芷含量最高（42.787%），杭白芷（28.727%）和亳白芷（25.053%）次之，川白芷最低（2.103%）。酯类化合物在川白芷中含量最低，其余相对含量为10.487%~25.959%。有机酸类化合物以亳白芷（29.837%）和祁白芷（24.815%）的含量最高。醇类化合物以杭白芷（14.648%）和祁白芷（11.169%）含量最高（ 表 3 ）。
六类白芷中相对含量（%）较高的挥发油成分
3. 讨论
现代药理学研究表明，白芷总挥发油成分具有抑制黑色素、抗氧化、镇痛、抗过敏、抗惊厥、抗痉挛等药理作用 [ 20 - 23 ] 。因此，深入发掘白芷及其近缘野生种的挥发油成分，探究不同白芷挥发油成分组成及各类白芷化学亲缘关系，对白芷资源的开发利用，药材质量标准的制定及临床用药具有重要意义。
GC-MS分析结果显示，6类白芷挥发油主要包括烷烃类、烯烃类、机酸类、酯类和醇类等五大类化合物，其中烷烃类化合物含量最高（平均相对含量34.291%），川白芷、杭白芷、禹白芷中相对含量最高的均为烷烃类化合物壬基环丙烷和环十二烷。祁白芷中相对含量最高的为正十六酸和环十二烷，亳白芷中相对含量最高的为正十六酸。张强等 [ 13 ] 报道杭白芷挥发油中含量最高的为壬基环丙烷（44.8%），李宏宇 [ 24 ] 报道白芷挥发油主要组成为有机酸类和碳烯类，这些研究结果与本研究结果基本一致。但与张世洋等 [ 25 ] 报道的白芷中含量最高的挥发油成分为醇类的结果差异较大（含量最高的化合物为十二醇），本研究中白芷挥发油的五大类化合物中，醇类化合物含量相对其他四类化合物较低（平均相对含量为8.499%）。造成这些差异的原因可能与白芷的栽培品种（遗传）、加工方式、药材前处理、挥发油提取方法以及化合物检索数据库的不同有关 [ 15 , 26 ] 。另外，该报道所选取的材料为市售样品，每种类型的白芷产地来源和贮藏时间均无法确定，这也是与本研究结果差异的原因。野生的兴安白芷挥发油中相对含量最高的为烯烃类化合物（相对含量42.787%），其中首次分离得到的化合物大根香叶烯B为兴安白芷挥发油中占比最高的成分（13.13%）。兴安白芷（根）在东北各省有些地区称“大活”或“独活”入药，能发表、祛风除湿，用于治疗伤风头痛，风湿性关节疼痛及腰脚酸痛等症 [ 27 - 29 ] 。其药理活性是否与挥发油中大根香叶烯B有关尚需进一步研究。
六类白芷挥发油聚类分析和主成分分析结果显示，野生兴安白芷独聚一类，这与其烷烃类化合物含量（3.881%）明显低于其他栽培白芷，而烯烃类化合物含量（42.787%）又显著高于其他栽培白芷有关。当前兴安白芷并不作药用白芷使用可能与其药用成分与栽培白芷差异较大有关 [ 14 ] ，5类栽培白芷可划分为两个分支，祁白芷（河北安国）和亳白芷（安徽亳州）聚为一支，推测原因，可能与二者相同基原（祁白芷， Angelica dahurica cv. ‘Qibaizhi’）及相近的地理生境有关 [ 3 ] 。禹白芷原植物亦为 Angelica dahurica cv.‘Qibaizhi’，其为何又与杭白芷和川白芷（杭白芷， Angelica dahurica cv. ‘Hangbaizhi’）聚为一类且与其中的川白芷化学亲缘关系更近呢？王梦月等 [ 17 ] 根据本草考证认为，杭白芷在宋代开始便在浙江杭州一带栽培，已有近千年的历史，而根据《遂宁县志》记载，川白芷距今也有400~600年的栽培历史，相传川白芷为明朝时期遂宁的四大家族中有人在外地做官，从浙江带回种籽（杭白芷）于四川遂宁栽培，种植面积逐年扩大。袁昌齐等 [ 30 ] 的研究认为，20世纪50、60年代，杭白芷种子出现断档，曾两次由四川调种子到浙江栽种，这说明杭白芷与川白芷在历史上曾种质互用，二者为同一种质来源。禹白芷相比于杭、川白芷栽培历史较短，但也有200余年 [ 17 ] ，禹白芷与川白芷挥发油成分组成更为接近，可能与二者异地引种导致种质混杂有关，笔者通过市场调研发现，在禹州中药材市场上，有大量的川白芷药材和种子售卖（这与川白芷为当前的主流商品，价格最高有一定关系），二者混种会进一步导致药材品质问题。上述六类白芷间的化学亲缘关系也得到了分子生物学证据的支持（核微卫星数据，未发表），这表明白芷化学表型受到遗传因素的影响。然而，兴安白芷是否为栽培白芷的野生来源尚需进一步结合形态学和分子系统学等手段展开研究确认。传统认为，杭白芷、川白芷“条大，体重，质坚，色白，粉性强，气味芳香”，品质上乘，疗效好。因此，相关管理部门应加强对白芷各类种源的管理，充分保障道地性明显的川（杭）白芷种源纯正。目前市面上已无杭白芷售卖，仅在浙江磐安有少量的散户种植该品种，笔者建议应尽快开展复种工作，防止这一栽培近千年的优质地方品种就此消失，同时也应尽快明确白芷的野生来源，为开展白芷的品种改良及创制提供遗传资源。
综上所述，本研究明确了6类白芷的主要挥发油成分及其含量，并基于此建立了6类白芷的化学亲缘关系，为白芷野生来源的进一步确定及白芷类药材资源开发利用、药材质量控制提供了参考依据。
Biography
田恩伟，博士，副教授，E-mail: moc.621@iewnenait
Funding Statement
国家自然科学基金（81603226）
Funding Statement
Supported by National Natural Science Foundation of China (81603226)
Article information
1,
2,
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田 恩伟 (Enwei TIAN)
南方医科大学中医药学院，广东 广州 510515, School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China 南方医科大学珠江医院药剂科，广东 广州 510280, Department of Pharmacy, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510280, China 广东省中药制剂重点实验室，广东 广州 510515, Guangdong Provincial Key Laboratory of Chinese Medicine Pharmaceutics, Guangzhou 510515, China
成 欣 (Xin CHENG)
南方医科大学中医药学院，广东 广州 510515, School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
刘 银榕 (Yinrong LIU)
南方医科大学中医药学院，广东 广州 510515, School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
陈 建玲 (Jianling CHEN)
南方医科大学中医药学院，广东 广州 510515, School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
晁 志 (Zhi CHAO)
南方医科大学中医药学院，广东 广州 510515, School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China 南方医科大学珠江医院药剂科，广东 广州 510280, Department of Pharmacy, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510280, China