新鲜牛肝(自购);蛋白胨(北京双旋微生物培养液制品厂,批号:20130430);麦芽糖(上海蓝季科技发展有限公司,批号:131109);盐酸半胱氨酸(武汉远大弘元药业有限公司,批号:130628);氯化钠(中盐宏博集团云梦云虹制药有限公司,批号:20130710);健康人血清(黄冈市中心血站惠赠);注射用青霉素钠(华北制药股份有限公司,批号:F3128502);注射用硫酸链霉素(山东鲁抗医药股份有限公司,批号:140209);参菊洗剂(黄冈市中心医院自制,批准文号:鄂药制字Z20110230,批号:130804,131221,140318,规格:每瓶250 mL,含生药量为0.54 g·mL ^-1 );洁尔阴洗液(四川恩威制药有限公司,批号:1305129,含生药量为1 g·mL ^-1 );0.9%无菌氯化钠溶液(按《中华人民共和国药典》方法 ^{[ 2 ]} 配制)。

医用净化工作台(苏州净化设备厂);HHB11420电热恒温培养箱(湖北省黄石市医疗器械厂);高压蒸汽灭菌器(上海三申医疗器械有限公司);80-2型离心机(上海手术器械厂);XS-18型生物显微镜(南京江南光电集团股份有限公司);KWY-100型电热干燥箱(武汉市武昌实验仪器厂);血细胞计数板。

参考文献[3-4]方法,并作如下改进:取新鲜牛肝150 g,切碎,加纯化水200 mL,置烧杯中加热至内外变色,于研钵中研磨成组织匀浆,再倒回原烧杯中,加纯化水500 mL,煮沸30 min,用5层纱布滤过,加纯化水至1 000 mL,搅匀,即得15%肝浸液。依次加入蛋白胨20 g、麦芽糖10 g、盐酸半胱氨酸2 g、氯化钠5 g,加热使溶解,搅匀,用滤纸过滤,调节pH值至5.8,分装于15 mm×175 mm玻璃试管中,每管8.0 mL,用棉塞和牛皮纸封口,115 ℃热压灭菌30 min。冷却,置37 ℃培养箱中培养24 h,证实无菌后,储存于-20 ℃冰箱,备用。使用前,取出培养液,置室温下融化,每管加无菌、灭活的健康人血清2.0 mL,即得肝浸液培养液10.0 mL。

用无菌棉拭子,取我院妇科门诊初次确诊且未经治疗的滴虫性阴道炎患者阴道后穹隆处分泌物,按无菌操作法 ^{[ 2 ]} ,接种于“1.3”项制备的肝浸液培养液10.0 mL中,初次及第2次传代每管均加入青霉素、链霉素各1 mg,以抑制杂菌生长,置37 ℃培养箱中培养48 h。用无菌吸管从近试管底部吸取混悬液0.1 mL,转入新的肝浸液培养液中,每2天传代1次。稳定培养5代后,显微镜下可见,虫体多为梨形,运动活跃,前端有一泡状核,核上缘有5颗排列成环状的基体,由此发出4根前鞭毛和1根后鞭毛,体侧有波动膜,虫体借助前鞭毛的摆动向前运动,并以波动膜的波动作螺旋式运动,经鉴定为阴道毛滴虫。用无菌吸管从近试管底部吸取混悬液1 mL,加肝浸液培养液10.0 mL,置离心机中1 500 r·min ^-1 ( r =10 cm)离心10 min,清洗3次,浓集虫体,加肝浸液培养液充分摇匀,用血细胞计数板计数每毫升培养液阴道毛滴虫数,再用培养液调整、定量为1×10 ⁵ 个·mL ^-1 。

实验分为0.9%氯化钠溶液组、洁尔阴洗液组和参菊洗剂组,采用液体培养液连续稀释法,按无菌操作,取参菊洗剂或洁尔阴洗液,先用肝浸液培养液分别稀释成含生药400.00mg·mL ^-1 的溶液。

取肝浸液培养液6支,每支10.0 mL,编号,排列在试管架上,于第1管中加入400.00 mg·mL ^-1 的参菊洗剂或洁尔阴洗液10.0 mL,混匀后吸取10.0 mL加入第2管中,混匀后再吸取10.0 mL加入第3管中,如此连续倍比稀释至第6管,混匀后自第6管吸取10.0 mL弃去,使成1/2,1/4,1/8,1/16,1/32,1/64的各种药液浓度,即各管参菊洗剂或洁尔阴洗液的浓度依次为200.00,100.00,50.00,25.00,12.50,6.25 mg·mL ^-1 。另取0.9%氯化钠溶液5.0 mL,加肝浸液培养液5.0 mL,作为阴性对照管。然后向各试管中加入“1.4”项下制备的定量的阴道毛滴虫混悬液100 μL,置37 ℃培养箱中培养,测定药物在不同浓度、时间内对阴道毛滴虫的作用。每一浓度组2支试管,平行操作3次。

在培养24 h时,分别用无菌吸管从近试管底部吸取混悬液0.1 mL,转入新的肝浸液培养液中,置37 ℃培养,于48,72 h再分别计数各管阴道毛滴虫的存活率。每一浓度2支试管,平行操作3次。

分别于培养2,4,6,8,12,24 h时,吸取各管虫液,涂片,覆上盖玻片,在高倍镜(×400)下,在视野的左上方、左下方、右上方、右下方和中心位置,各随机观察20个虫体,共100个虫体,记录虫体的形态和活动状况,计数阴道毛滴虫总数及死亡数,计算各管阴道毛滴虫死亡率。阴道毛滴虫死亡判断标准 ^{[ 5 - 6 ]} :虫体变圆,边缘不整,轮廓不清,失去原有的透明度,鞭毛和波动膜不运动甚至缺失,内含大量颗粒。虫体有鞭毛或波动膜,运动活跃或有微弱运动者,均判断为活虫。死亡率(%)=死亡滴虫数/观察的滴虫总数×100%。

0.9%氯化钠溶液组阴道毛滴虫为正常形态,多为梨形,运动活跃,可见不停挥动的前鞭毛和体侧的波动膜。参菊洗剂组和洁尔阴洗液组的阴道毛滴虫形态均发生明显改变,首先虫体变圆,鞭毛和波动膜运动明显减弱或停止,滴虫停止运动,细胞质内出现空泡,有的虫体细胞质呈颗粒状或虫体破裂,繁殖受抑制,随着药物浓度升高和作用时间延长,阴道毛滴虫的死亡数逐渐增多。0.9%无菌氯化钠溶液组于2,4,6,8,12,24 h观察,虫体运动活跃,虫体密度逐渐增加。

见 表1。

参菊洗剂浓度在12.50~25.00 mg·mL ^-1 时,对阴道毛滴虫即有抑制作用。50.00 mg·mL ^-1 以上浓度的参菊洗剂对阴道毛滴虫有抑制、杀灭和裂解的作用,转种培养后均无阴道毛滴虫生长,可见50.00 mg·mL ^-1 为参菊洗剂体外杀灭阴道毛滴虫的最低有效浓度。200.00 mg·mL ^-1 浓度组在8 h内裂解所有阴道毛滴虫。400.00 mg·mL ^-1 浓度组4 h杀虫率即达100.00%。

参菊洗剂各浓度组阴道毛滴虫的死亡率与相同浓度的洁尔阴洗液组比较,均差异无统计学意义(均 P >0.05),经转种培养后,参菊洗剂各浓度组阴道毛滴虫的存活率与相同浓度的洁尔阴洗液组比较,均差异无统计学意义(均 P >0.05)。

笔者曾尝试用新鲜猪肝浸出液制备肝浸液培养液,结果制成的培养液较浑浊,改用牛肝浸出液制成的培养液清澈透明,利于显微镜检查。小牛血清含丰富的血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素和无机物等,而少含抗病原体物质,较适于培养阴道毛滴虫和细胞,但基层单位不易获得新鲜无菌小牛血清,采用较易获得的健康人血清代替,也可达到较好的效果。

参菊洗剂中的苦参有抗阴道毛滴虫作用,对痢疾杆菌、大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用;黄柏有杀灭阴道毛滴虫作用,对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和多种致病性皮肤真菌均有抑制作用;蛇床子有抗阴道毛滴虫作用,对絮状表皮癣菌、石膏样小芽胞菌、羊毛状小芽胞菌有抑制作用 ^{[ 7 ]} 。参菊洗剂处方组成除含有洁尔阴洗液中的苦参、黄柏、蛇床子外,尚含千里光、雄黄等药材。千里光、雄黄对阴道毛滴虫也有一定的抑制和杀灭作用 ^{[ 8 - 9 ]} 。本研究结果表明,参菊洗剂对阴道毛滴虫有较强的抑制和杀灭作用,随着药物浓度的增加和作用时间的延长,滴虫死亡率也升高,即参菊洗剂作用的强度与药物浓度、作用时间呈正相关,且效果与洁尔阴洗液基本一致,为其在临床上广泛使用提供了科学依据。

The authors have declared that no competing interests exist.