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紫外可见(UV Vis)分光光度法是在不同行业与细分市场中进行各种应用的强大技术。
当物质吸收特定波长的光达到最大值时,物质与其紫外可见光谱之间会存在一种独特的关系。这种关系可用于:
通过本页,您将会了解关于紫外可见光谱及其应用的基本知识。
在下列部分中找到关于紫外可见分光光度法基础知识与应用的答案:
性能测试 |
法定标准物质(CRM) |
仪器测试参数 |
验收标准 |
|
USP 42 NF 37 |
欧洲 药典 10 |
|||
波长准确度与 重复性 |
Ho(ClO 4 ) 3 : 4 % Ho 2 O 3 ,10 % v/v HClO 4 空白: 空气 |
14个波长 (240 nm – 650 nm) Xe: 2个波长(260.6, 528.6 nm) |
紫外区(200~400 nm):±1 nm 可见光区(400~780 nm):±2 nm (标准偏差) <0.5 nm |
紫外区(< 400 nm): ± 1 nm 可见光区(> 400 nm): ± 3 nm |
光度 准确度与 重复性** |
K 2 Cr 2 O 7 ,0.001 M HClO 4 空白 : 0.001 M HClO 4 |
60 mg/L 0 A – 2 A, 235、257、313、350 nm |
如果吸光度≤ 1A 准确度: ± 0.010A 重复性: 标准偏差 ≤ 0.005 A
如果吸光度> 1A 准确度: ± 1% 重复性: 标准偏差 ≤ 0.5%
|
准确度: ±0.010 A或±1 %,以较大值为准
|
烟酸: 0.1 M HCl 空白 : 0.1 M HCl |
12 mg/L 0.26 A – 1.6 A 213、261 nm |
|||
光度线性 |
K 2 Cr 2 O 7 ,0.001 M HClO 4 空白 : 0.001 M HClO 4
|
6 – 200 mg/L,最大吸光度值3.0 A, 235、257、313、350 nm |
所有被测量的过滤器均符合 光度准确度验收标准 |
R 2 > 0.999 |
烟酸: 0.1 M HCl 空白 : 0.1 M HCl |
6 – 60 mg/L,最大电流2.5 A 213、261 nm |
|||
根据方法A测出的杂散光 (SFRM) |
1.2 % w/v KCl/H 2 O; 10 mm光程 空白 : 1.2 % w/v KCl/H 2 O, 5 mm光程 |
198 nm时最大吸光度值 |
≥ 0.7 A |
(NA) |
根据方法B测出的杂散光(SWM) |
1.2 % w/v KCl/H 2 O; 10 mm光程 空白 : H 2 O, 10 mm光程 |
198 nm时A 最大吸光度值 |
≥ 2.0 A |
≥ 2.0 A |
分辨率 |
0.02 % v/v 甲苯-正己烷溶液 空白 : 正己烷/ 正庚烷(欧洲 药典 10) |
A 最大,269 /A 最小,267 |
>1.3 |
级别规定请参见相应专著 |
**《欧洲药典》中未指定光度重复性 (精确度) S.D. ——标准偏差 |
为了按照行业标准对产品进行独特定义,建立了不同色标。这些色标包括:
电子秤 |
标准 |
应用 |
赛波特值 |
ASTM D156, ASTM D6045 |
确定燃料(煤油、汽油、柴油、石脑油等)在储存时是否受到污染或发生降解 |
APHA/Pt-Co/Hazen |
ASTM D1209 |
黄度指数用作水、化学、石油与塑料工业纯度检验的指标 |
加德纳值 |
ASTM D1544/D6166, DIN EN ISO 4630-2 |
用于测试通过加热获得颜色的产品,例如:树脂、脂肪酸、清漆与干性油等 |
CIELAB |
DIN EN 11664-4, DIN 5033-3, 4630, ASTM Z 58.7.1 DIN 6174 |
香精与香料以及食品与饮料行业的质量控制 |
EBC |
MEBAK方法2.13.2,EBC方法8.5,EBC方法9.6 |
以EBC单位测量啤酒、麦芽、焦糖等物质的颜色强度与浊度(雾度)。 |
USP/EUP |
USP-24专著631,EP方法2.2.2 |
药物质量控制 |
Hess-Ives |
DGK测试方法F 050.2 |
用于测试化学品与表面活性剂液体(主要用于化妆品行业) |
核酸的质量控制
核酸定量是分析前所采用的一种必不可少的方法,可在许多分子生物学分析中获得准确可靠的结果,例如:下一代测序(NGS)、聚合酶链式反应(PCR)、实时PCR(定量PCR;qPCR)、克隆与转染。
核酸的定性与定量控制可以通过测定核酸的纯度与浓度进行。
DNA分析方法
A260和核苷酸浓度相关,A280和蛋白质的氨基酸残基相关。酪氨酸和色氨酸这两种氨基酸在280 nm处吸光,苯丙氨酸则在260 nm处吸光。这样可以直接利用吸光度测量计算A260/A280比率来检测DNA的纯度。优质DNA的A260/A280比率为1.7–2.0
蛋白质定量分析
总蛋白定量的不同方法包括A280、二辛可宁酸(BCA)、Bradford、Lowry、Pierce和其他新型检测方法。由于存在具有芳香环的氨基酸,因此溶液中的蛋白质在280 nm处具有最大值,由于存在肽键,因此在大约220 nm处具有最小值。
利用Warburg公式计算浓度:
蛋白质浓度(mg/ml)= 1.55 X(A280读数)–0.76 X(A260读数)
如想了解关于使用紫外可见光谱分析DNA的更多信息,请下载《260/280比率: 蛋白质污染指标》应用手册。
材料 |
理论透射范围(nm) |
远紫外石英 |
170——2700 |
光学玻璃 |
320——2500 |
近红外石英 |
220——3800 |
紫外硅 |
220——2500 |
紫外塑料 |
220——900 |
一次性PS比色皿 |
340——750 |
一次性PMMA比色皿 |
285——750 |
|
水溶液 |
有机分子 |
难以去除颗粒 |
蛋白质 |
重金属 |
脂肪酸 |
清洗液 |
等容积的3 M HCl与乙醇
用50%硝酸清洗 |
浓缩HNO 3 或2 M HCl |
等容积的乙醇与3 M HCl
|
在室温下用胰蛋白酶培养
(不建议使用乙醇和丙酮进行清洁。) |
等容积硫酸2 M与50%去离子水
王水
|
等容积的IPA与去离子水 |
浸泡时间* |
10分钟 |
10分钟 |
30秒 |
一整夜 |
20分钟 |
擦拭 |
不同的光谱法主要由它们使用的辐射、能量与材料之间的相互作用以及它们用于的材料与应用类型进行区分。常用于化学分析的光谱法包括:原子光谱、紫外可见光谱、红外光谱、拉曼光谱与核磁共振。
光谱类型 |
辐射类型 |
交互作用 |
波长 |
ϒ射线光谱 |
ϒ射线 |
原子核 |
<0.1 nm |
X射线荧光光谱 |
X射线 |
内层电子 |
0.01——2.0 nm |
真空紫外光谱 |
紫外(UV) |
离子化 |
2.0——200 nm |
紫外可见光谱 |
紫外可见分光光度法 |
价电子 |
200——800 nm |
红外与拉曼光谱 |
红外 |
分子振动 |
0.8——300 mm |
微波光谱 |
微波 |
分子转动 |
1 mm——30 cm |
电子自旋共振光谱 |
电子自旋 |
||
核磁共振光谱 |
无线电波 |
核自旋 |
0.6——10 m |
假设有一个包含原子的官能团,原子中有一对或多对不吸收紫外线/可见光辐射的孤对电子。然而,当这个官能团连接到发色团时,会改变吸收的强度与波长。这种现象称作辅助色素或增色基团。
辅助色素的存在会导致峰值或信号向更长波长的位置偏移,这种现象称作红移。对红移基团产生作用的官能团是甲基、羟基、烷氧基、卤素和氨基等取代基。
分光光度计的光谱带宽(SBW)与单色仪系统的物理狭缝宽度和光学色散有关。分辨率指仪器将光分成有限、明显波长区域并且区分每个有限区域的能力。光谱带宽通常用于扫描仪器,而分辨率通常用于阵列仪器。
表中显示了梅特勒托利多的超越系列紫外/可见分光光度计的分辨率,使用正己烷中的甲苯以及等效光谱带宽对分辨率进行测量。
仪器 |
光谱分辨率 |
等效光谱带宽(nm) |
UV5 |
>1.5 |
< 2.0 |
UV5Bio |
>1.5 |
< 2.0 |
UV5Nano |
>1.7 |
< 1.5 |
UV7 |
> 1.9 |
≤ 1.0 |
光源 |
光谱范围 (nm) |
区域 |
使用寿命 |
钨丝灯 |
350——2500 |
VIS + IR |
3,000小时 |
氘弧灯 |
190——400 |
UV |
1,000小时 |
氢灯 |
190——400 |
UV |
1,000小时 |
闪烁氙灯 |
190——1100 |
UV + VIS + NIR |
5,500小时* |
温度会对吸光值产生影响。不同的溶剂在不同的温度条件下会经历不同的相互作用。因温度变化而改变的溶液参数为:
光度噪声、波长准确度/重复性、光度重复性和杂散光等光学性能参数在10——40 °C范围内不受温度影响。
而诸如光度分辨率(甲苯/己烷比)与光度准确度波长(K 2 Cr 2 O 7 in HClO 4 )之类的光学参数在10——40 °C内显示出从0.014到-0.034/单位的温度依赖性。
使用高性能恒温系统(例如:酷T与CuvetteChanger)可以实现对紫外可见分光光度法的温度控制。 点击此处 了解更多信息。
杂散光定义为到达检测机的光,该光不来自于仪器的光源并且不遵循光路,导致在相应的波长发生偏差。因此,检测机测量的光强度高于实际应有的强度。相反,这还意味着测量的吸光度低于真正吸光度,因为杂散光会导致其降低。这种效应在吸光度值更高(样品浓度高)时更为明显。
下载白皮书,了解关于杂散光来源和准确测量的更多信息:
紫外可见阵列分光光度计中的样品室是打开的,这是因为阵列式仪器使用 反向光学器件 并 同步检测 光谱的所有波长。
反向光学器件: 光线穿过样品后发生衍射。因此,只有一小部分外部环境光会对某一波长区域内的信号产生作用。
同步检测: 使用同时提供2048个光强度信号的阵列式检测机可在一秒内记录全光谱。由于测量速度非常快,因此可明显减小环境光的影响。