Thermochemical Studies of Ni(II) and Zn(II) Ternary Complexes Using Ion Mobility-Mass Spectrometry

Introduction

本研究描述了一种使用市售离子淌度质谱仪的新技术，该技术允许测定替代金属结合（amb）三元金属配合物[amb + M（II）+ NTA]解离的相对热化学，其中M = Zn或Ni和NTA = 硝基三乙酸（图1 ）。这些反应模拟了在固定化金属亲和色谱（IMAC） ¹ ^， ² 期间附着在NTA固定化金属上的amb标记的重组蛋白的解离。例如，使用amb A ^{和

H

的amb七肽标签描述该方法（

图2

）（从以前的研究
³
^，
⁴
，
⁵
，
⁶
^，
⁷
^，
⁸
，
^{⁹
^，
^{¹⁰
^，
¹¹
^，
¹²
中选择））具有锌（II）和Ni（II）结合特性，因此具有作为纯化标签的潜在应用。然而，所描述的过程可用于评估任何有机金属系统中的热化学能量。这些 amb 肽在 Aa
_1-Aa
₂
和 Aa 6-Aa
₇
位置中具有金属结合
_{位点，这些位点与 NTA 的羧酸盐和胺位点竞争。三个中心amb氨基酸提供间隔物（Gly
₃
），两个臂的铰链（Pro
₄
）和长距离π金属阳离子相互作用（Tyr
₅
）。}}}}

[amb+M（II）+NTA] ^- 配合物的整体1−电荷状态由其潜在结合位点的质子化状态决定。由于存在具有2+氧化态的Ni（II）或Zn（II），因此必须有三个去质子化带负电荷位点的网。[原子核+M（II）+NTA] ^- 配合物的分子建模预测，这是两个来自NTA的质子和一个来自安布的质子（即[原子核-H+M（II）+NTA-2H] ^- ）。产品通道包含离子物质和中性物质（即[氮氧化物-3H+甲基（II）] ^-+ 安姆或[安姆-3H+甲基（II） ^--+ 氮氧化物（3H+甲基）-+氮氧化物“）。在手稿中，“-3H”被排除在复合物的名称之外，但读者应该知道-3H是隐含的。该仪器测量两种离子质荷比（ m / z ）物种的相对强度。ES-IM-MS分析的一个主要属性是，它允许检查特定 m / z 物种的反应性，如这里和以前的amb研究 ³ ^， ⁴ ^， ⁵ ， ⁶ ^{^，
⁷
^，
⁸
^，
⁹
^，
¹⁰
^，
¹¹
^，
¹²
所使用的那样。}

使用碰撞诱导的解离获取大型配合物的热化学数据是一个具有重要意义的主题 ¹³ ^， ¹⁴ 。包括动力学方法在内的方法不利于拟合一系列能量的数据，也不考虑多碰撞环境 ¹⁵ ^， ¹⁶ ^， ¹⁷ ^， ¹⁸ 。在这里，由阿门特劳特，欧文和罗杰斯使用引导离子束串联质谱法开发的阈值CID（TCID）方法应用于 ¹⁹ ，用于利用行波离子导引的新型ES-IM-MS仪器平台。TCID方法允许对三元配合物解离到其两个产物通道中的相对热化学分析，并包括一个阈值定律，该定律描述了反应物（本研究中的三元配合物）和惰性目标气体（在这种情况下为氩气）之间的碰撞能量转移。该方法包括反应物内部能量分布 ²⁰ 上的积分，反应物和目标气体 ²¹ 之间的平移能量分布，以及总角动量分布 ²² ^， ²³ 。解离概率和统计赖斯 -拉姆斯伯格-卡塞尔-马库斯（RRKM）校正由有限的时间窗口产生的动力学变化，用于观察产物 ²⁴ 。对于两个独立的产品渠道，竞争性 TCID 方法允许同时拟合两个相互竞争的产品渠道。配合物的解离是通过轨道过渡态，它具有产物的性质，但由锁定偶极子 ²⁵ 保持在一起。将TCID方法并入CRUNCH程序 ²⁶ 中，并在此处描述用户界面的操作，以评估三元[amb +M（II）+NTA] ^- 配合物的两个解离通道的热化学性质。CRUNCH程序可根据开发人员 ² ⁶ 的要求提供。

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Protocol

注： 图 1 显示了该协议的概述。

1. 试剂的制备

购买冻干的amb肽（纯度>98%）并将其储存在-80°C冰箱中。
购买纯度>99%的六水合硝酸锌（II）和硝酸镍（II）六水合物。
注意：硝酸镍（II）六水合物对环境和健康有害。
购买亚硝基三乙酸、聚-DL-丙氨酸聚合物、超纯/微量金属级乙酸铵、氢氧化铵、冰醋酸和HPLC级乙腈。

2. 储备溶液的制备

肽原液
1. 通过使用不少于三个有效数字称量10-20mg冻干肽并将其置于1.7 mL聚丙烯微量离心管中，制备浓度为12.5 mM amb的水溶液。
2. 向微量离心管中加入适当体积的去离子水（>17.8 MΩ cm）。盖上盖子，搅拌均匀，至少倒置20次。
3. 从12.5 mM amb溶液中产生50μL等分试样，并将其放入标记的1.7 mL微量离心管中。将等分试样储备溶液储存在-80°C。
4. 金属离子库存解决方案
  1. 通过使用不少于三个有效数字称量10-30mg金属硝酸盐六水合物并将其置于1.7 mL聚丙烯微量离心管中，制备浓度为12.5 mM的水溶液。
  2. 向微量离心管中加入适量的去离子水。盖上盖子，搅拌均匀，至少倒置20次。将50μL等分试样储备溶液储存在-80°C。
  3. 氮氧化物离子原液解决方案
    1. 通过使用不少于三个有效数字称量10-30mg NTA并将其置于1.7 mL微量离心管中来制备NTA水溶液。
    2. 在微量离心管中向NTA中加入适量的去离子水，以达到12.5 mM的最终浓度。盖上盖子，搅拌均匀，至少倒置20次。将50μL等分试样储备溶液储存在-80°C。
    3. 乙酸铵储备溶液：称取30.8mg乙酸铵，加入40 mL去离子水中，得到10 mM溶液。用1mM氢氧化铵将乙酸铵溶液的pH值调节至pH 7.7。
    4. 聚DL丙氨酸储备溶液：通过将1.0mg PA溶解在去离子水中，制成1 mL，1，000 ppm的聚DL-丙氨酸（PA）储备溶液。全面混合。创建50μL等分试样并将其放入单独标记的微量离心管中。将1，000 ppm溶液储存在−80°C。
    3. 电喷雾离子淌度质谱（ES-IM-MS）碰撞诱导解离（CID）分析
    1. 通过注入500μL0.1 M冰醋酸，然后注入500μL0.1 M氢氧化铵，最后500μLpH 7.7乙酸铵溶液，清洁ES入口管和金属毛细管来制备仪器。
    2. 将 12.5 mM amb 原液溶液液化至室温。通过用去离子水进行两次连续稀释，产生0.125 mM amb的最终浓度。每次稀释后全面混合。
    3. 将12.5 mM金属离子原液溶液液化至室温。通过用去离子水连续稀释两次，产生0.125 mM金属离子的最终浓度。每次稀释后全面混合。
    4. 液化 12.5 mM NTA 储备溶液。通过用去离子水进行两次连续稀释，产生0.125 mM NTA的最终浓度。每次稀释后全面混合。
    5. 为了制作2 mL三元复合物样品，将800μL0.125 mM NTA溶液和400μL0.125金属离子溶液加入2mL微量离心管中，并与至少20个倒置物充分混合。加入400μL乙酸铵溶液（pH 7.7）和400μL0.125mM amb溶液，与至少20个倒置充分混合，并使样品在室温下平衡10分钟。
    6. 将2 mL样品装入2.5 mL钝鼻注射器中，并使用仪器的注射泵以10μL / min的流量将样品注入仪器的ES中。
    7. 将仪器置于负 IM-MS 模式。使用仪器 ²⁷ 的典型操作条件进行如下实验。
      1. 以10μL /min的流速将样品注入保持在−2 kV的ES毛细管中，氮气解溶流速为500 L / h。将 ES 源和解溶温度分别设置为 130 °C 和 263 °C。将采样和提取锥体分别设置为 25 V 和 3 V。
      2. 对于CID实验，使用四极杆质量分析仪使用单同位素峰的 m / z 选择[amb + M（II）+ NTA] ^- 三元复合物的同位素模式，分辨率设置为低质量= 4.5，高质量= 16.5。
        注意：[amb+M（II）+NTA] ^- 离子被传递到连续的三个行波（T波）离子导流上。
      3. 确保疏水阀 T 波的氩气流量为 3 mL/min，压力为 2.83 x ^10-2 mbar。将碰撞能量（CE）设置为5 V的陷阱，以避免三元复合物的任何解离。让陷阱收集三元络合物离子，然后使用14 V的陷阱直流偏置将它们释放（200 μs释放时间）到离子迁移率（IM）T波离子导导中，这将IM入口处络合物的解离保持在最低限度。
      4. 使用 20 mL/min 流速的超 _{纯 N 2} 缓冲气体，确保 IM 离子导流的压力为 0.507 mbar。IM离子导波的每次开始和结束扫描时，IM中的T波高度为7 V至30 V，速度为290 m/s至801 m/s。
      5. 将传输 T 波的氩气流和压力设置为与陷阱 T 波相同的值。转移T波用于利用转移CE对三元[amb+M（II）+NTA] ^- 配合物进行碰撞诱导的解离。
      6. 在分辨模式下使用透射四极杆选择带负电荷的 [amb+M（II）+NTA] ^- 复合物的 m/z 同位素图谱。
        
        通过打开质谱程序并选择光谱来识别 m / z 同位素模式。选择 “工具”>同位素模型 “ 。在弹出窗口中，列出复合物的分子式，选中“ 显示带电离子 ”框，输入1作为负离子的电荷，然后单击“ 确定 ”。
        
        在显示的复合物同位素图案中，注意最低质量峰值。在仪器软件中，选择 “四>配置文件设置” 。在打开的窗口中，选择 手动固定 ，然后输入最低同位素模式峰的质量。单击“ 更新 ”，然后单击“ 关闭” 。
        
        再次选择 “设置 ”，然后单击“ 解析四元” 。使用5分钟的运行持续时间和2秒的扫描时间，在一系列传输碰撞能量范围内以增量方式收集负离子ES-IM-MS光谱。
        注意：初步传输能量可以在26-60 V的范围内以2 V的间隔进行测试。所检查的转移碰撞能量的最终范围应证明三元配合物在最低能量下没有解离，并且在最高能量下完全解离到产物中。对于高质量的统计分析，这种ES-IM-MS分析应由不同的人在不同的日期对每个安布三元复合物进行至少3倍，以确定均值和标准偏差。
        
        4. 断续器碰撞截面分析
        
        用500μL0.1M冰醋酸清洁ES入口管和金属毛细管，然后用500μL0.1M氢氧化铵，最后用500μLpH 7.7乙酸铵溶液清洁。
        
        将1，000 ppm PA储备溶液液化至室温并进行两次连续稀释;用去离子水稀释至100 ppm PA，然后用1：1比例的去离子水和HPLC级乙腈稀释至10 ppm PA溶液。
        
        使用仪器操作条件收集10 ppm PA样品的负离子IM-MS光谱10分钟。
        注意：注射流速和ES源条件与CID实验相同（步骤3）。对于CCS的测量，四极杆质量分析仪处于非分辨模式，并将所有离子传递到连续的三个T波离子导流上。陷阱T波和IM T波离子导板的操作与CID实验相同。转移T波电池的碰撞能量为4 V，允许离子通过而不解离。
        
        按照步骤3.2.-3.6所述制备每个三元配合物。
        
        收集每个三元复合物的IM-MS光谱5分钟。
        注意：使用与步骤 4.3 中相同的仪器条件。
        
        收集10 ppm PA样品的负离子IM-MS光谱10分钟。
        注意：在CCS测定中使用在安布三元配合物之前和之后收集的PA口径的到达时间的平均值。
        
        5. 分析静电放电
        
        通过将三元复合物及其产物的理论 m / z 同位素模式与实验IM-MS光谱相匹配来识别物种。
        
        打开质谱程序并选择 色谱图 以打开一个新窗口。
        
        在 色谱图 窗口中，单击 “文件”>“打开 ”以查找并打开所需的IM-MS数据文件。
        
        右键单击鼠标，在色谱图上拖动，然后松开。MS 频谱将显示在单独的频谱窗口中。
        
        在显示光谱的新窗口中，选择 “工具>同位素模型” 。将弹出一个小窗口。输入 amb 物质的分子式，选中 显示带电离子 框，然后输入所需的电荷状态。单击 “确定” 。
        
        要区分IM-MS光谱中的所有物种，请在光谱窗口中重复此过程并记录其 m / z 同位素范围。
        
        对于三元 amb 复合物及其产物，使用它们的 m/z 同位素范围来识别它们并提取它们的到达时间分布（ATD）。
        
        打开离子淌度分离软件，选择 文件>打开 以查找并打开数据文件。
        
        单击鼠标左键并拖动以放大三元复合物的 m/z 同位素范围 [amb+M（II）+NTA] ^- 。
        
        使用 “选择” 工具，单击鼠标左键并拖动以选择步骤 5.1 中确定的 [amb+M（II）+NTA] ^- 的特定同位素范围。单击“ 接受当前选择” 按钮。
        
        要消除任何重合的 m/z 物种或背景信号，请使用选择工具选择与三元复合物关联的 ATD。单击“ 接受当前选择” 按钮。
        
        要将ATD文件导出到质谱分析软件，请转到 文件>导出 ，然后单击“ 保留漂移时间” 。如果需要，请重命名该文件，并将该文件保存在相应的文件夹中。
        
        通过对提取的ATD曲线下的面积进行积分来确定物种的相对强度。
        
        在 色谱图 窗口中，打开离子淌度分离软件中保存的导出文件。选择“ 进程 ”，然后选择 “集成” 。使用峰峰值幅度设置为 20，然后单击 “确定” 。
        
        记录集成区域，如 色谱图 窗口所示。重复步骤 5.2.2.-5.2.5。对于这两种产品，即[国家贸易协定+甲基（二）] ^- 和[安布+甲基（二） ^]- 。
        
        重复步骤 5.2.1.-5.3.2。对于记录的每次转移碰撞能量。
        
        利用每个传递碰撞能量点的三元复合物 [amb+M（II）+NTA] ^和两个乘积 [NTA+M（II） ^]- 和 [amb+M（II）] ^- 的集成 ATD 区域，归一化为相对百分比尺度。
        
        通过输入三元复合体及其产品的身份及其在每次碰撞能量下的集成ATD来创建电子表格。
        
        对于每种碰撞能量，利用 [AMB+M（II）+NTA] ^- 、[NTA+M（II）] ^- 和 [Amb+M（II）] ^- 的集成 ATD 之和，将其各自的 ATD 归一化为相对百分比尺度。
        
        从重复 TCID 测量中，找到每个数据点的平均值和标准偏差。使用氩气（m Ar）碰撞气体的平均质量将实验室框架转移 _{碰撞能量（
        
        E
        
        _lab
        ）转换为质心碰撞能量（
        
        E
        
        _cm
        
        _）：
        
        E
        
        _cm
        =
        
        E
        
        _实验室
        （
        
        m
        
        _Ar
        ）/（
        
        m
        
        _Ar
        +
        
        m
        
        _复合物
        ）。
        
        注：
        
        E
        
        _cm
        表示与氩气碰撞的最大能量，可用于三元配合物的解离。}
        
        在相对强度（%）与质心碰撞能量（eV）的图形中绘制[amb+M（II ^{）+NTA]-、[NTA+M（II）]
        ^-
        和[amb+M（II）]
        ^-
        的个体百分比强度的平均值和标准差，以展示物种的相对强度如何随碰撞能量的函数而变化。}
        
        6. 分析确定碰撞横截面（CCS）的平均到达时间
        
        打开离子淌度分离软件和包含10 ppm PA样品的IM-MS谱的文件，该光谱的转移碰撞能量设置为4 V.提取每个带负电荷的PA物质的ATD，并使用选项 “保留漂移时间 ”将文件导出到质谱软件（参见步骤5.2.5.）。对第二个 PA 校准文件重复上述步骤。
        
        打开离子淌度分离软件。使用 “文件>打开” 打开“打开”以打开包含 PA 校准器之间记录的 amb 三元复合物的 IM-MS 谱的文件之一。提取每个三元配合物的ATD，并使用 “保留漂移时间 ”选项将其文件导出到质谱软件（参见步骤5.2.5.）。
        
        使用横截面校准方法 ²⁸ 来计算三元复合物的CCS及其产物。
        
        在电子表格中，使用等式 1计算在氦缓冲气体 ³¹ 中测量的CCS（Ω） ²⁹ ^， ³⁰ 中每个带负电荷的PA物质的校正CCS（Ω _c ），其中 z =三元配合物的电荷， e _c = 1.602 x 10 ⁻¹⁹ C; m _N ₂ = 氮的质量（u）， m _离子 =三元配合物的质量 ²⁸ 。
        
        通过首先从相应ATD曲线的最大值获得平均到达时间（t _A ），然后应用 等式2 ，找到PA校准器和三元配合物的漂移时间（t _D ），其中 c =探测器延迟系数（1.41 ms，检查仪器，因为这可以在仪器之间变化）和 m / z =PA校准品或amb三元配合物的质量荷比。
        吨 _D = 吨 _A （2）
        
        通过绘制 PA 校准器 的 t _D 与 Ω _c 来创建图形。然后，使用 公式3 ，用最小二乘回归拟合数据，找到常数 A' 和 B ，其中 A' 校正仪器中的电场、温度和压力， B 校正T波IM器件的非线性行为。
        Ω _c = A' t _D ^B （3）
        
        利用 amb 三元配合物的 A' 和 B 常数以及 t _D 值，使用 公式 3 计算其Ω _c ，使用 公式 1 计算其Ω。通过这种方法估计的CCS值的绝对误差约为2% ²⁹ 。
        
        7. 计算方法
        
        使用在结构建模和计算软件 ³³ 中实现的半经验 PM6 ³² 方法来定位从 CID 实验中观察到的 [amb+M（II）+NTA] ^- 三元配合物以及离子和中性产品对的几何优化构象：[amb+M（II）] ^- + NTA 和 [NTA+M（II）] ^- + amb。有关如何开发和提交计算的详细信息，请参阅 补充文件中 的计算可视化工具用法。
        注意：对于目前的系统，PM6方法正确地再现了实验数据，但一般来说，可以使用任何可靠且计算可行的量子化学方法。
        
        对多个不同的起始结构运行几何优化和频率计算，以探索不同的构象、质子状态和潜在的结合位点。记录每个三元配合物及其产物的每个定位静止点的电子+零点能量。
        注意：几何优化的起始结构应研究结合位点和构象排列的不同可能组合。起始结构基于先前定位的 B3LYP ³⁴ [amb+M（II）] ^- 符合性 ³ ^， ⁴ ^， ⁶ 。对于[Amb+M（II）+NTA] ^- ，NTA被定位为与位于Aa _1-Aa 2-Aa _6-Aa ₇ 的原子的取代基位 _{点和羧酸盐末端竞争Zn（II）的单线态自旋态或镍（II）的三重态自旋态
        
        。}
        
        使用一个程序，该程序可以使用这些量子化学计算 ³⁵ 中的原子坐标执行在氦缓冲气体（CCS _He ）中测量的精确碰撞截面测量。
        注意： _为从量子化学计算定位的肽结构中计算准确的CCS而开发的程序包括MobCal ³⁶ 和HPCCS ³⁷ ^， ³⁸ 。
        
        选择展示伦纳德-琼斯CCS的最低能量构象，该 _符合 IM-MS测量的CCS _He ，用于选择三元配合物和解离产物的结构，以包括在下面的CRUNCH建模中。
        
        8. 紧缩建模
        
        以讨论部分中描述的格式（“CRUNCH 输入文本文件格式”）创建一个文本文件。
        注：该文件包括以下各列：（−1）质心碰撞能（ E _cm ），（1） [amb+M（II）] ^- 乘积的相对强度的平均值，（2） [amb+M（II）] ^- 强度的标准差，（3） [NTA+M（II）] ^- 乘积的相对强度的平均值，以及（4） [NTA+M（II）] ^- 强度的标准差。
        
        对 E _厘米 -两个反应通道的依赖强度 [原子力气道+M（II）+NTA] ^- 到 [安布+M（二）] ^- + 新界和 [安布+姆（二）+新界] ^- 至 [新唐人协会 ^- + 在紧缩程序中使用 TCID 技术。
        注意：将PM6振动和旋转频率用于三元复合物以及两个离子和中性产物通道。使用三元复合物、氩气碰撞气体以及离子和中性产物的平均质量。使用PM6计算或NIST数据库中的值来表示极化率（Å ³ ）和中性产品的偶极矩（德拜）。
        
        从“紧缩”主菜单中，打开文本文件（.GB5）含有 E _厘米依赖性相对强度的产品。“回答否 ” 以读取参数 。
        
        从 CRUNCH 主菜单中，选择建模 >设置所有参数 。从反应模型选项中，选择默认的 阈值 CID 选项，然后选择 RRKM，在 三元复合物 ²⁰ 的能量转移分布上进行积分，为 建模的独立产品通道 输入 2 ，然后选择 计算横截面 。输入否以 执行任何两个产品通道具有相同的离子质量？
        
        对于 产品通道 # 1 ，输入列 [ 1 ] 作为 [amb+M（II）] ^- 乘积的 实验数据 ，输入列 [ 2 ] 表示 [amb+M（II）] ^- 产品 的标准差 ，输入列 [ 5 ] 表示 未卷积的模型横截面 ，输入列 [ 6 ] 表示 卷积模型横截面 。输入 0 表示拟合残差。
        注意：这些列号对应于步骤 8.1 中输入文件中的列。如讨论中所述（“CRUNCH 输入文本文件格式”）。
        
        对于 产品通道 # 2 ，输入列 [ 3 ] 作为 [NTA+M（II）] ^- 乘积的 实验数据 ，输入列 [ 4 ] 表示 [NTA+M（II）] ^- 产品 的标准差 ，列 [ 7 ] 表示 未卷积的模型横截面 ，输入列 [ 8 ] 表示 卷积模型横截面 。输入 0 表示拟合残差。
        
        对于 非卷积模型的类型 ，选择 0 K横截面（包括动力学偏移）， 其中包括由于从碰撞单元到TOF检测器 ¹⁸ 的50 μs时间窗口而导致的动力学偏移的统计RRKM校正。
        
        对于 卷积选项 ，选择 蒂尔南双积分 ，其中包括三元络合离子和氩气碰撞气体 ²¹ 之间平移能量分布的卷积。
        
        对于 数值积分方法 ，选择 具有预先保存的横截面的高斯正交 ，后跟积分点数 = 32 ，标准差数 = 3.0 ，第二个积分的标准差数 = 3.0 。
        
        三元络离子（u）的质量是从中自动读取的。GB5文本文件，接着是碰撞气体的质量（氩气为 39.948 ）;离子束的 FWHM 使用默认值 0.20 eV ，气体温度 使用 298.15 K 。该程序自动从中读取的最小和最大质心碰撞能量。GB5 文本文件;使用 最小能量增量 的默认值。
        
        使用 比例因子 Sig0 的默认值，使用 “否 ”表示 允许缩放单个产品通道 ，并使用 默认值进行 N 和 M 。对于 g（i）计算方法 ，选择 在 ro 振动状态密度上的积分 ，其中包括三元复数 [amb+M（II）+NTA] ^- 的内能分布 ²⁰ 。
        
        从输入分子参数的选项中，输入 G 以读取结构建模文件 ³³ ，其中包含三元复合物的PM6振动和旋转频率。回答是的，问题是 反应物之一原子？ 写入建模文件的位置和名称。
        注意：用于输入振动和旋转频率的其他选项包括 读取参数文件 （将从文本文件中读取参数）或 编辑/输入常量 （允许手动输入每个参数）。
        
        使用 NIST 推荐的 PM6 比例因子（1.062）缩放频率。有关缩放的更多详细信息，请参阅讨论（“振动频率的缩放因子”）。三元复合物中的原子数是从文件中读取的。回复否分子 是线性的吗？ 输入 反应物的描述 （例如，H+ 锌 + NTA- + Ar）。
        
        输入 1 作为 离子电荷 ， 输入1.664 作为 氩气的极化性 ³⁹ 。 离子的质量 和 目标的质量 分别用于三元络合物和氩气，并自动从中读取。GB5 文本文件。输入 0 表示 谐波振动 。
        注：以下选项用于为高振动频率或低振动频率选择不同的比例因子。 高频输入 1.062 ，低频输入 0.0 （参见讨论：振动频率的比例因子）。图中显示了缩放的频率。选择 0 以选择“ 无更改” 。
        
        按 Enter 键从步骤 8.2.10 中输入的结构建模文件 ³³ 中读取 1-D 和 2-D 旋转常量 。为 受阻转子处理 选择默认值 0 ，为 分子对称性 选择 默认值 1 。
        注意：程序显示输入的数据;击中输入 无更改 .
        
        选择默认的 300 K 作为 反应物温度 。选择 “集成 ”作为 降低状态数组密度的方法 。选择“ 是 ” 截断能量分布 。输入 40000 cm ⁻¹ 作为分配的最大能量 ， 输入 2.0 cm ⁻¹ 表示 箱子大小 ， 输入 32 表示 能量分布中的点数 。
        注意：按 Enter 2x 并检查 截断的 32 pt 阵列 的填充>0.9。如果>0.9，请输入 No 以 更改箱体或冷凝因子 。如果<0.9，请输入是并更改分配和/或 箱体大小 的最大能量 。
        
        对于 TCID/RRKM 模型的参数 ，请为 “更改 ”选择“ 是 ”，输入 0 表示 固定时间 ，输入 0.000050 秒 作为 检测窗口的上限 。对于所使用的仪器，这是离子从转移碰撞池传播到TOF检测器所需的时间，并使用 公式2 计算。
        
        对于 通电分子 ，输入 C 以从已输入的反应物中 复制值 。输入 −1 表示源转换状态（TS）， 输入 0 表示目标 TS， 输入 P 以继续。
        
        对于 产品通道 1 ，从 解离通道选项 中选择 1 表示 单转换状态 ，为 顺序解离 选择 0 表示 none 。对于 过渡状态类型 ，选择 1 作为轨道。
        
        选择 G 可读取包含 [amb+M（II） ^{] -} + NTA 产品的 PM6 旋转和振动参数的建模程序文件。输入否对于 PSL TS 物种之一是原子的吗？ 输入 [amb+M（II ^{）] 文件} 的位置和名称。使用 1.062 表示 刻度频率 ，按 Enter 键表示原子数，然后输入 No 表示 分子是线性的吗？
        
        输入包含 NTA 产品的振动和旋转频率的建模文件的位置和名称。使用 1.062 表示 刻度频率 ，按 Enter 键表示 原子数 ，然后输入 No 表示 分子是线性的吗？ 输入 轨道TS 的描述，例如H + Zn-...腾讯网.
        
        输入 1 表示 [amb+M（II ^）] 离子 的电荷 ，并输入 NTA 的 极化率 （ 16.12 Å ³ ）和 偶极矩 （ 4.6183 Debye ）。选择 0 K 作为 旋转温度 ， 选择锁偶极子 来处理轨道跃迁状态。输入 [amb+M（II ^{）] 离子} 和 NTA 的平均质量（u）。
        
        输入 0 表示 谐波振动 。输入 1.062 表示高频， 输入 0.0 表示低频。有关缩放频率的更多详细信息，请参阅讨论部分;显示缩放的频率。选择 0 以选择“ 无更改” 。按 Enter 键从建模文件中读取 1-D 和 2-D 旋转常量 。选择 0 表示 受阻转子 ， 选择 1 表示 分子对称性 ， 选择 1 表示 反应简并 。输入“ 无更改” 选项。
        
        对于 产品通道 2 ，为 单转移状态 选择 1 ，为 顺序解离 选择 0 表示无，为 过渡状态类型 选择 轨道 1 。
        
        选择 G 以读取包含 [NTA+M（II）] ^和 amb 产品的 PM6 旋转和振动参数的建模文件。输入否对于 PSL TS 物种之一是原子的吗？ 写入 [NTA+M（II）] ^- 建模文件的位置和名称。
        
        使用 1.062 作为 尺度频率 ，按Enter键读取原子数，输入 N 表示 分子是线性的吗？ 写入 amb 建模文件的位置和名称。使用 1.062 作为 尺度频率 ，按Enter键表示原子数，输入 N 表示 分子是线性的吗？
        
        输入 轨道 TS 的描述（例如，NTA+锌-...输入 1.0 作为[NTA+ M（II）] ^- 离子 的电荷 ，并输入 amb的极化率 （ Å ³ ）和 偶极矩 （Debye），选择 0.0 K作为 旋转温度 和 锁定偶极子 用于处理轨道过渡态。输入 [NTA+M（II）] ^和安倍产物的平均质量（u）。
        注：输出文件包含 amb 的极化率和偶极矩。极化率以玻尔 ³ 为单位，需要转换为Å ³ 的单位。
        
        输入 0 表示 谐波振动 。输入 1.062 表示高频， 输入 0 表示低频。有关缩放频率的更多详细信息，请参阅讨论。图中显示了缩放的频率。选择 0 以选择“无更改”。按 Enter 键从建模文件中读取 1-D 和 2-D 旋转常量 。选择 0 表示 受阻转子 ， 选择 1 表示 分子对称性 ， 选择 1 表示 反应简并 。输入 无更改 。
        
        要 处理非活动 2-D 旋转 ，请选择默认选项 统计角动量分布 ，并在 J 分布上积分 P（E，J） 。在积分点数中使用默认值 32 。
        注意：这些选择选择在总角动量 J 水平 ¹⁶ ^， ¹⁷ 上的积分方法。生成的输出允许调查人员检查所有输入是否正确。
        
        选择相对于 通电分子 选项的 活化能 ，并为 乘积通道1 输入 相对能量 （eV），该能量接近[amb+ M（II）] ^- 乘积的相对强度与质心碰撞能的图形中观察到的阈值能量（图4 ）。
        
        对于 乘积通道 2 ，输入接近 [NTA+M（II）] ^乘积的强度与质心碰撞能量图中观察到的阈值能量的相对能量（eV）。要计算每个产品渠道 的状态数 ，请使用条柱大小 2.0 。按回车键，然后 按“否” 继续。
        
        从“ 模型 ”菜单中，选择 “优化参数以拟合数据 ”，然后分别输入开始和结束数据拟合的最小 能量和最大能量 。
        注：使用包括两个通道阈值的小能量范围。有关更多详细信息，请参阅讨论：将所选TCID模型拟合到实验数据的能量范围。
        
        选择 -1 作为 加权模式实验标准差 。根据数据，选择 可接受的最小标准偏差 ，通常为 0.01 至 0.001。选择“ 否 ”可 优化各个通道的缩放 ，选择 0 可选择 迭代次数 。
        注意：使用标准差的替代方法是统计选项。
        
        使用 E ₀ 收敛极限 的默认值，然后选择“ 否 ”以 将任何参数保持在当前值 。输入 0.5 和 2.0 eV 作为 下限和上限，以避免优化失败 ，并为 导数求值方法 选择中心有限差。 使用缺省值作为 数值精度 ，然后选择 No 作为 更改导数步长。
        注意：另一 种方法是选择“ 是”以 将任何参数保持在当前值 。该方法在讨论中进一步描述：参数的优化。
        
        从“ 优化 ”菜单中，选择“ 开始优化” 。紧缩程序将根据实验数据优化选定的TCID模型。
        注意：如果优化没有找到令人满意的拟合，请在更改菜单中尝试更改 能量范围 ，以仅覆盖从阈值上升的前几个强度。当找到合理的拟合时，增加能量范围并再次拟合。其他有助于找到与数据匹配的选项包括选择 将任何参数保持在 优化参数 中的当前值，以及更改 权重中的权重 选项。有关这些选项，请参阅讨论。
        
        找到与数据拟合的模型后，按 Enter 键，直到出现“ 模型 ”菜单。如果只有部分能量范围实验数据与 TCID 模型拟合，请选择 计算并卷积模型 以将模型拟合扩展到所有实验碰撞能量。
        
        在“ 模型 ”菜单中，选择“ T 处的增量 H”和“S” 。
        注意：非卷积 CRUNCH 模型将 0 K 阈值能量与三元配合物解离到两个独立的乘积通道中的 0 K 焓（Δ H ₀ ）相关联（ 表 2 ）。解离的298 K焓（Δ H ₂₉₈ ）和吉布斯自由能（Δ G ₂₉₈ ）也是使用反应物和产物PM6旋转和振动频率的统计力学热和熵校正推导出来的。

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Representative Results

竞争性碰撞诱导的 A 和 H 的 [amb+M（II）+NTA] ^- 三元配合物解离为 [amb+M（II）] ^- + NTA 或 [NTA+M（II）] ^-- + amb，如图 3 所示。AMB 显示为 A 或 H ，M = 锌或镍。[A+锌（II）+NTA] ^- 三元配合物（ 图3A ）表现出约0.7 eV碰撞能（CE）的明显阈值以产生[A + Zn（II）] ^-，以及约0.9 eV以产生[NTA + Zn（II）] ^- 。[A+镍（II）+NTA] ^- 络合物（ 图3B ）的解离对于[NTA+镍（II）] ^- 和[A+Ni（II）] ^- 产物表现出相似的阈值（~1.1 eV），[NTA+Ni（II）] ^- 的相对强度增加到90%，而[A+Ni（II）] ^- 的强度不超过18%。对于[H+Zn（II）+NTA] ^- 三元配合物（ 图3C ），主要产物是[H+Zn（II）] ^- 从约0.6 eV的阈值上升到约85%的相对强度，在能量高于1.0 eV时，[NTA+锌（II）] ^- 上升到约30%。还有一个来自[H-H ₂ O + Zn（II）] ^-的水分损失通道。对于[H+ Ni（II）+ NTA] ^- （ 图3D ），[H + Ni（II）] ^- 从约0.9 eV的阈值上升到约40%的相对强度，而[NTA + Ni（II）] ^- 从〜1.0eV上升到约80%。图中包括CE，其中三元复合物解离了50%。Ni（II）三元配合物需要比Zn（II）三元配合物高0.31-0.37 eV的CE才能解离50%。这表明Ni（II）配合物更稳定，需要更高的CE才能解离，使用TCID技术进一步研究了这一点。

图 4 显示了竞争性 TCID 方法，该方法允许同时拟合两个竞争的产品通道。

[安博+明（二）+新界] → [安博+明（二）] ^- + 新界（1）

[安博+米（二）+新三] → [新台币+二）] ^- + 安博（2）

势能面（PES）说明了通电三元络合物解离到竞争的产物通道中，并显示了用于模拟[amb _H + Zn（II）+ NTA] ^- 解离的PM6几何优化物质。PES中包括三元复合物的状态密度和乘积的状态总和。0 K阈值能量 E ₁ 和 E ₂ 等于反应1和2的0 K焓变化。

图5 显示了本研究中使用的其他三种几何优化三元配合物的结构。这些物种是根据它们预测的电子和零点能量以及它们与IM-MS测量的碰撞横截面（CCS _He ）的一致性来选择的。表1 显示三元配合物LJ CCS _He 和实验IM-MS CCS He之间存在一 _致性，因为它们在相互不确定性中一致。[amb+M（II）] 和 amb 的构象基于我们之前的 DFT 建模 ³ ^， ⁴ ， ⁵ ^， ⁶ 的发现。 ^{这些PM6构象的分子参数用于三元配合物的能量分辨解离的TCID建模，包括它们的ロ振动频率，用于计算它们的密度和状态之和。}

图6 显示了与能量分辨产品强度拟合的卷积紧缩TCID阈值。卷积拟合包括 [amb+M（II）+NTA] ^- + Ar 反应物的可用能量和角动量分布。未卷积拟合（未显示）预测了三元络合物解离的焓（Δ H ₀ ）的0 K变化，表2 显示了反应1和2的Δ H ₀ 和Δ H ₂₉₈ （kJ / mol）。对于Zn（II）三元配合物的解离， A 和 H 在反应1中均表现出Δ H ₀ ，反应2分别比Δ H ₀ 低31 kJ/mol和15 kJ/mol，表明 A 和 H 的Zn（II）亲和力均大于NTA.[A+Ni（II）+NTA] ^- 三元配合物在反应1和反应2中分别表现出Δ H ₀ = 146和148 kJ/mol，表明 A 和NTA对Ni（II）具有相似的亲和力。然而，[H+Ni（II）+NTA] ^- 的解离表明，反应1的Δ H 0比反应2的Δ H ₀ 低36 kJ/mol，表明 H 具有比NTA更大的Ni（II）亲和力。总体而言，[涤+镍（II）+NTA] ^- 配合物表现出比其[amb+锌（II）+NTA] ^- 对应物更高的解离焓，但解离为[NTA+镍（II）] ^-的 A 除外。表3 显示了吉布斯自由能（Δ G ₂₉₈ ）的缔合和相反反应的形成常数（ K ）：

[安布+姆（二）] ^- + 新界 → [安布+姆（二）+新界] ^- （3）

[新唐人协会 ^- + 安布 → [安布+姆（二）+新塔] ^- （4）

表3 表明，在所有情况下， Ni（II）三元配合物的形成都比Zn（II）配合物更具能动性，并且表现出更大的地层常数 K .反应4（即，amb标签与NTA金属离子络合物的关联）特别令人感兴趣，因为它表示amb标记的重组蛋白与IMAC柱内NTA固定的金属离子结合。反应4为[ _{amb A} +Ni（II）+NTA]的形成表现出最自发的Δ G ₂₉₈ = 53.1 kJ/mol和最高的形成常数 K = 2.01 x 10 ⁹ 。

图 1 ：ES-IM-MS TCID 方法的概述 ，请单击此处查看此图的大图。

图2 ：amb A和H肽的主要结构。 颜色突出显示了潜在的金属结合位点。请点击此处查看此图的大图。

图 3 ：质心、能量分辨（eV）阈值碰撞引起的 [amb+M（II）+NTA] ^的解离。 图中显示了积离子 [原子核酸根 ^离子] ^{_{^{质量中心碰撞能量，其中[amb + M（II）+ NTA]
^-
三元复合物有50%的解离，包括在图中。

请点击此处查看此图的大图。}}}

图 4 ：能量分辨 TCID 方法的模型。 [氮 _{气 H} +锌（II）+氮杂氩] ^- +氩气之间的碰撞导致与[安布 _H +锌（II）] ^-+ 氮氧化物+锌（II） ^-+ 氩 _气产物的解离。阈值能量 E ₁ 和 E ₂ 分别等于 _{反应的
₀
K 解离
^{焓 → （}
Δ
^{_{^{H

（II）
^-→
_{_{请点击此处查看此图的大图。}}}}}}

图 5 ：PM6 几何优化的三元 [amb+M（II）+NTA] ^- A 和 H 的复合物。 在实验数据的TCID建模中使用的构象。这些顺恒者是通过比较它们的PM6电子能量以及它们的LJ碰撞横截面（CCS _He ）与IM-MS测量的CCS _He 的比较来从其他候选结构中选择的。请点击此处查看此图的大图。

图 6 ：能量分辨、碰撞诱导的 [amb+M（II）+NTA] ^的解离。 对于物种 A 和 H，显示了 [amb+M（II） ^]- 和 [NTA+M（II）] ^- 的乘积离子与卷曲的紧缩阈值拟合。显示的能量（eV）值是反应 [amb+M（II）+NTA] ^- → [amb+M（II）] ^- + NTA 或 [amb+M（II）+NTA] ^- → [NTA+M（II）] ^{- +} amb 在 0 K 处解离的焓。

图 7 ：CRUNCH 文本输入文件的格式。 该文件包含作为质心碰撞能量的函数形成的产物离子的平均相对强度及其标准偏差。请点击此处查看此图的大图。
[氮+锌（II）+氮氧化物] ^- [安布+镍（II）+新界] ^- 214±2 219±2 211±5 212±3 ^一个 ES-IM-MS CCS _测量的不确定度为 ±4 Å ² 。
表 1：[amb+M（II）+NTA] 的 PM6 一致性的 LJ 碰撞横截面比较。 将PM6一致性的理论横截面与用ES-IM-MS _测量的实验CCS进行比较。
[氮+锌（II）+氮氧化物] ^- → [安布+镍（II）+新界] ^- → [安布+锌（二）] ^- + 新界 [氮氧化物+锌（二）] ^- + 安布 [安布+尼（二）] ^- + 新界 [新烟气+镍（二）] ^- + 安布 Δ H ₀ Δ H ₂₉₈ Δ H ₀ Δ H ₂₉₈ Δ H ₀ Δ H ₂₉₈ Δ H ₀ Δ H ₂₉₈
表 2：TCID 分析的热化学结果。 能量依赖性反应 [amb+M（II）+NTA] ^- → [amb+M（II） ^]- + NTA 或 [amb+M（II）+NTA] ^- → [NTA+M（II）] ^- + amb，显示了从未卷积的 TCID 模型拟合得出的 0 K 解离焓（Δ H ₀ ），以及使用 PM6 旋转和振动频率的统计力学热校正 _的 298 K 解离焓（Δ H ₂₉₈ ）。值以千焦/摩尔为单位。
[安布+锌（二）] ^- + 新界→ [氮氧化物+锌（二）] ^- + 安布→ [安布+尼（二）] ^- + 新→ [新烟气+镍（二）] ^- + 安布→ [氮+锌（II）+氮氧化物] ^- [氮+锌（II）+氮氧化物] ^- [安布+镍（II）+新界] ^- [安布+镍（II）+新界] ^- ΔG ₂₉₈ ΔG ₂₉₈ ΔG ₂₉₈ ΔG ₂₉₈ -34.0 约9.05 x 10 ⁵ -21.8 约6.59 x 10 ³ -45.7 约1.01 x 10 ⁸ -53.1 约2.01 x 10 ⁹ -29.3 约1.36 x 10 ⁵ -30.2 约1.95 x 10 ⁵ -47.0 约1.71 x 10 ⁸ -31.1 约2.81 x 10 ⁵

表3：吉布斯自由缔合能（Δ G ₂₉₈ ）和平衡形成常数（ K ）。 Δ G ₂₉₈ 和 K 在 298 K 下用于反向反应 [安布+米（II）] ^- + 氮氧化物→ [安布+米（二）+新烟气] ^- 和 [安博+米（二）] ^-和 [安塔+米（二）]-安→ ^{源自 Δ

H

₂₉₈
和使用 PM6 旋转频率和振动频率的统计力学熵计算。Δ

G

₂₉₈
的数值以千焦/摩尔为单位。}

补充文件。 请按此下载此档案。

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Discussion

关键步骤
ES-IM-MS 阈值碰撞诱导解离（TCID）分析。 TCID在氩气存在下使用转移T波电池作为碰撞池。在解离之前，前体离子在通过离子迁移率（IM）电池时通过与氮气的低能碰撞而热化。这导致比使用陷阱作为碰撞池 ⁶ ^， ⁴⁰ 所实现的更可重复的能量分辨TCID。解离前[amb+M（II）+NTA] ^- 的热化也允许使用298 K温度表征三元配合物的可用内能。转移单元中的解离也意味着三元络合物及其产物离子在检测器上具有相同的平均到达时间，这对于识别仅在转移细胞中发生的三元复合物的解离非常有用。可能发生解离的其他区域是ES源（采样锥保持在25 V以避免这种情况）或IM单元的入口处。在这些区域中，由三元配合物解离产生的产物离子与转移单元中产生的产物离子具有不同的漂移时间，因为产物离子与IM单元中的三元复合物分离。这些产品离子被排除在分析之外。在该协议中，仅使用前体和共对准的产物离子的集成到达时间分布来确定其强度。陷阱偏置设置是控制注入IM电池的电压，该电压有助于IM电池入口处的CID。陷阱偏置设置为14 V，将背景解离保持在最低限度，同时不会过度影响整体强度。先前的研究 ⁴¹ 确定亮氨酸脑啡肽二聚体的有效温度（上限）在IM细胞入口处为449 K。然而，当二聚体通过IM电池时，有效温度迅速下降。这里研究的amb复合物的到达时间表现出高斯分布，表明它们在通过IM细胞时被热化。

断续器碰撞截面分析。 CCS漂移时间是通过与氮气碰撞的实验发现的。这些值使用已知标准的校准曲线转换为氦气衍生的CCS漂移时间。这一点至关重要，因为用于测量PM6符合性CCS的程序需要更常用的氦气标准。

技术的修改和故障排除
紧缩输入文本文件格式。 适用于 CRUNCH 程序的输入文本文件如图 7 所示。从上到下的顺序标题是文件位置和CRUNCH的版本;日期;能量数量;不包括第一能量列的数据序列数;源文件;前体复合物的质量;氩气质量;实验温度;创建日期;x数据指定为−1（质心碰撞能量）;和离子束的半最大值处的全宽（FWHM）。对于每个 TCID 实验，必须修改这些值。离子束的FWHM能量扩散和能量零点应通过延迟电位分析（RPA）来确定，通过低电压扫描CE并监测总离子电流。然而，在当前研究中IM的工作条件下，当传输CE设置为其最低值时，离子电流信号仅减少了约50%。离子束能量零点和FWHM只能在通过降低出口IM透镜的额外延迟时才能测量。在后一种情况下，RPA曲线导数的FWHM在实验室框架中给出了1.5 V的典型离子能量扩散，在质心框架 ¹³ 中给出了0.035 eV的典型离子能量扩散。

压力行与碰撞池内的压力有关，但此处不使用。碰撞池中氩气的压力可以变化，TCID数据可以在三个压力下测量，以推断出单个碰撞条件。然而，本研究仅使用了一种压力，并且该压力导致多次碰撞。为单次碰撞开发新平台是一个正在进行的研究领域。质量与强度在下面的列中的两个产物离子有关。停留可以保留为默认值。这五列是质心碰撞能量（指定为−1）;质量为898.30 u的物质的离子强度平均值;物质离子强度的标准偏差为898.30 u;质量为253.53 u的物质的离子强度平均值;和物质离子强度的标准偏差253.53 u。

分子建模
最初通过使用从 ^{先前研究
⁹
^，
^10，11
，
^{¹²
^，
¹³
中得出的模型来缩小符合者的数量。
^{CRUNCH拟合需要仔细筛选反应物，活化分子和过渡态，以获得准确的阈值能量。以前的研究
⁹
^，
¹⁰
^，
¹¹
^，
¹²
^，
¹³
已经包括对[amb + M（II）]符合性的广泛筛选，以获得具有此处CRUNCH建模中使用的参数的结构。仅使用具有

反式

肽键的复合物，因为只有它们与IM-MS测量的CCS
_He
^10一致
。B3LYP和PM6分子建模方法都预测了最低能量[amb + M（II）]
^-
构象，其表现出Aa 1-Cys
_{2-Cys
_{₇
和羧酸盐末端配位Zn（II）或Ni（II）
¹⁰
^，
¹¹
^，
¹²
^，
¹³
。熟悉已知模型的行为可以更有效地确定 [amb+M（II）+NTA
^{] 的新}
符合性。为了帮助确定符合性，由于PM6方法定位了较低能量的一致性，因此将它们过滤掉并系统地重新评估，直到最可行，最低能量的一致性仍然存在。}}}}}

紧缩建模
观察解离的时间窗口。 在这项研究中，使用了从转移池开始到TOF分析仪末端的50 μs时间窗口，其中放置了多通道板检测器。使用转移池中的活化和TOF质量分析仪入口之间的实验时间窗口可能更好，因为如果活化的离子在其在反射子TOF中解离，则这种亚稳态衰变将在不同的 m / z 下测量。然而，在这项研究中，在质谱中观察到的产物离子都可以识别为图3 所示的未修饰 的m / z 物质。这表明亚稳衰变不是问题。进一步的研究可以通过检查具有高阈值的已知反应并使用50 μs时间窗口和RRKM建模检查是否获得正确的阈值能量来研究这一点。

振动频率的比例因子。 使用了NIST推荐的PM6（1.062）振动频率的比例因子。这些对于拟合[A+锌（II）+氮氧化物] ^- 、[A+镍（II）+NTA] ^- 和[H+锌（II）+NTA] ^-数据是令人满意的。对于较高能量通道在熵上优于较低能量通道的某些情况，可能需要额外缩放第二个通道的频率。一种方法是将频率缩放到900 cm ⁻¹ 以下（因为这些是最不准确的），以松动频率并使TS在熵上更受青睐。

参数优化。 使用“ 是 ”选项将 任何参数保持在当前值 有助于成功拟合数据。对于第一次拟合，保持 E ₀ （2），并通过优化 CONST、E ₀ （1）和 N 变量将模型 TCID 拟合到数据。找到良好的拟合后，参数选项和 将任何参数保持在当前值 可用于保存 CONST、E ₀ （1）和 N，同时允许 E ₀ （2）优化数据。最后，一旦 E ₀ （2）被优化，在参数选项中，应允许所有四个参数 CONST、E ₀ （1）、E ₀ （2）和 N 对数据进行优化。

用于将所选 TCID 模型拟合到实验数据的能量范围。 用于拟合实验数据的能量范围应再现尽可能多的实验强度数据，同时保持阈值区域的良好拟合。首先可以将TCID模型拟合到实验数据阈值处的小能量范围。人们可以选择一种起始能量，该能量在强度阈值上升行为之前表现出背景强度。一旦TCID拟合优化到实验数据范围，范围应增加0.1 eV，并且应再次优化拟合。应重复此过程以拟合尽可能多的数据范围，同时保持阈值区域的拟合。

热化学分析。 应将 T 端 H 和 S 三角 选项的热化学结果与一系列不同的能量范围拟合数据进行比较，以估计 TCID 模型拟合的标准差。要比较的拟合应包括较小的范围，这些范围与具有较大范围的较小范围（包括较高能量）很好地拟合。

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Disclosures

作者没有利益冲突需要披露。

Acknowledgments

本材料基于美国国家科学基金会在1764436，NSF REU计划（CHE-1659852），NSF仪器支持（MRI-0821247），物理和天文学成功奖学金（PASS）NSF项目（1643567），韦尔奇基金会（T-0014）以及能源部（TX-W-20090427-0004-50）和L3通信的计算资源下支持的工作。作者感谢肯特·欧文（内华达大学里诺分校）和彼得·阿门特劳特（犹他大学）分享CRUNCH计划，并就PBA的安装提供建议。作者感谢加州大学圣巴巴拉分校的迈克尔·鲍尔小组分享西格玛计划。

Materials
Company Catalog Number Comments Acetonitrile HPLC-grade Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A998SK-4 Alternative metal binding (amb) peptides PepmicCo (www.pepmic.com) designed peptides were synthized by order Ammonium acetate (ultrapure) 97061-014 Ammonium hydroxide (trace metal grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A512-P500 Driftscope 2.1 software program Waters (www.waters.com) software analysis program Gaussian 09 Gaussian Electronic Structure Modeling Software GaussView Gaussian Graphical Interface to Visualize Computations Glacial acetic acid (Optima grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A465-250 Ion-scaled Lennard-Jones (LJ) method Sigma Michael T. Bowers’ group of University of California at Santa Barbara MassLynx 4.1 Waters (www.waters.com) software analysis program Microcentrifuge Tubes 87003-294 1.7 mL, polypropylene Microcentrifuge Tubes 87003-298 2.0 mL, polypropylene Ni(II) nitrate hexahydrate (99% purity) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) A15540 Poly-DL-alanine Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) P9003-25MG Waters Synapt G1 HDMS Waters (www.waters.com) quadrupole - ion mobility- time-of-flight mass spectrometer Zn(II) nitrate hexahydrate (99%+ purity) Alfa Aesar (www.alfa.com) 12313
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