理化学研究所（理研） 開拓研究本部 新宅マイクロ流体工学理研白眉研究チームの新宅 博文　理研白眉研究チームリーダー、マハメッド・ナディ・アブデルモエズ　研修生、東京大学 大学院理学系研究科の小口 祐伴　特任助教、上村 想太郎　教授、京都大学 大学院医学研究科の飯田 慶　特定助教らの共同研究グループ ^※ は、１つの細胞から核 ＲＮＡ ^注１ ）と細胞質 ＲＮＡ ^注１） を分画して、それぞれの遺伝子発現を解析できるマイクロ流体技術を基盤とする「１細胞ＲＮＡ分画解読法（ ＳＩＮＣ－ｓｅｑ法 ^※１） ）」を開発しました。

本研究成果は、遺伝子発現制御の理解を通じて細胞生物学の研究を加速し、将来的には、遺伝子治療や創薬、微生物産業などへの応用展開が期待できます。

近年、細胞の多様性を理解するために「 １細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ法 ^注２） 」が用いられています。ＲＮＡは核内で発現した後、細胞質に移動してタンパク質に翻訳されるまでにさまざまな修飾を受けますが、これまで、１細胞から核ＲＮＡと細胞質ＲＮＡに分離して、網羅的に遺伝子発現を解析する技術はありませんでした。

共同研究グループは、マイクロ流路における電場と流れを制御して、１細胞から核ＲＮＡと細胞質ＲＮＡを分離して並列に解読解析するＳＩＮＣ－ｓｅｑ法を開発しました。そして、本手法を用いて１つの細胞内のＲＮＡの局在や遺伝子発現の相関を解析できることを実証しました。さらに、これらが、 細胞周期 ^注３） ＲＮＡスプライシング ^注４） などの生命機能と密接に関わっていることを示しました。

本研究の一部は日本学術振興会（ＪＳＰＳ） 科学研究費補助金 挑戦的萌芽研究「単一細胞のＲＮＡおよびＤＮＡ同時抽出・解析技術の開発（研究代表者：新宅 博文）」および基盤研究（Ｂ）「マイクロ・ナノ電気穿孔法による細胞核への分子導入法の開発（研究代表者：新宅 博文）」の支援を受けて行われました。

本研究成果は、英国の科学雑誌「Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ」のオンライン版（６月６日付け：日本時間６月６日）に掲載されます。

図　ＳＩＮＣ－ｓｅｑ法の概要

＜研究の背景＞

近年、「１細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ法」により１つの細胞の中に存在するＲＮＡを網羅的に計数することが可能になり、細胞ごとの遺伝子発現を詳細に理解できるようになりました。しかし、１細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ法では、解析対象となる１細胞を単離することが必要不可欠であるため、単離が難しい脳神経細胞などでは、細胞の代わりに単離した核を用いる「核ＲＮＡ－ｓｅｑ法」が使われ始めています。

核ＲＮＡと細胞質ＲＮＡは、ＲＮＡの局在などにより異なる発現パターンを持つ可能性が複数の細胞を利用した解析から知られています。そのため、核ＲＮＡ－ｓｅｑ法を１細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ法の代用として利用する方法の妥当性は不明でした。また、核ＲＮＡと細胞質ＲＮＡの発現を１細胞レベルかつ網羅的に比較することで、ＲＮＡスプライシングなどの遺伝子発現調節機構に関して新たな知見が得られると期待されていました。

しかしこれまで、１細胞から核ＲＮＡと細胞質ＲＮＡを分離して網羅的に遺伝子発現を解析する技術はありませんでした。加えて、１細胞に含まれるＲＮＡ量は１０ピコグラム（ｐｇ、１ｐｇは１兆分の１グラム）程度と非常に少量であることも、核ＲＮＡと細胞質ＲＮＡを分離して別々に解析するための技術的障壁の１つでした。

共同研究グループは、マイクロ流体工学と生命科学の融合により、核と細胞質分子を正確に分離するシステムを構築し ^※２） 、１つの細胞から核ＲＮＡと細胞質ＲＮＡを並列に解読解析することを可能にしました（ 図１ ）。

このマイクロ流体システムは、マイクロ流路内に１細胞を捕捉するオリフィス構造（流体を流す小さな穴）を持っています。細胞補足後に外部電場を加えることで、オリフィス構造の近くに形成される集中電場により細胞膜が選択的に破砕され、細胞質ＲＮＡが効率的に抽出され、核と細胞質ＲＮＡが正確に分画されます。本手法は新宅理研白眉研究チームリーダーが２０１４年に開発した手法 ^※３ 、 ^４） と比較すると、加える電圧をおよそ２０分の１程度に下げることができます。このことにより、装置の簡略化、電気伝導性の高い細胞懸濁液の使用などの選択肢が広がりました。また、分離した核と細胞質ＲＮＡはマイクロ流体システムから別々に回収し、これらを独立した分析にかけ、遺伝子の局在を網羅的に知ることができます（ 図２Ａ ）。

さらに、１例として核ＲＮＡと細胞質ＲＮＡの並列解読解析を実施し、それぞれの遺伝子発現パターンに見られる相関性の全貌を１細胞レベルで調べました。その結果、遺伝子発現データから、核ＲＮＡと細胞質ＲＮＡの発現はおおむね相関しており、核ＲＮＡ－ｓｅｑ法による１細胞解析の妥当性が示されました。さらに、相関性が比較的高い群は細胞周期に関わる遺伝子を多く含むことが分かりました。一方で、明確な相関性が観察されない、あるいは逆相関する遺伝子群も一定数存在し、それらがＲＮＡスプライシングなどの特徴的な機能を持つ可能性が示されました（ 図２Ｂ ）。

※２） 新宅 博文、藁谷 卓哉、上村 想太郎、小口 祐伴、生体高分子分画用チップ、それを用いた生体高分子の分画方法、および生体高分子の分析方法、 特許第6338262号

※３） Juan G. Santiago, Hirofumi Shintaku, Simultaneous Extraction and Separation of RNA and DNA from Single Cells Using Electrophoretic Techniques, US 14/593,925 (2015/1/9), PCT/US2015/010884(2016/4/7)

※４） Hirofumi Shintaku, Hidekazu Nishikii, Lewis A. Marshall, Hidetoshi Kotera, and Juan G. Santiago, On-Chip Separation and Analysis of RNA and DNA from Single Cells, Analytical Chemistry, Vol. 86, No. 4 (2014), pp 1953–1957.

＜今後の期待＞

従来の１細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ法に加えて今回開発したＳＩＮＣ－ｓｅｑ法を利用することにより、核と細胞質間でのＲＮＡ輸送を含む遺伝子発現の転写後制御の理解が進み、将来的には、それらの知見をもとに遺伝子発現を効果的に制御することで、遺伝子治療や創薬、微生物産業などへ応用展開されることが期待できます（ 図３ ）。また、本技術による分離対象の必要要件は、溶液中で電荷を持つことだけであるため、細胞内のＲＮＡ以外の分子や細胞内小器官の分離・分析技術の基盤となる可能性があります。

Ａ）本研究で開発したＳＩＮＣ－ｓｅｑの概要。マイクロ流体技術で１細胞を核と細胞質ＲＮＡに分画し、それぞれをＲＮＡ－ｓｅｑで解析。マイクロ流路（幅５０マイクロメートル（μｍ、１μｍは１００万分の１ｍ）、深さ２５μｍ）に設けたオリフィス構造に細胞を捕捉し、電気的な細胞膜の破砕と細胞質ＲＮＡの抽出、核との分画を可能にする。分画後はそれぞれのサンプルを回収してさまざまな分析に利用できる。

Ｂ）上から順に、オリフィスに捕捉した１細胞、細胞質ＲＮＡ抽出後の核、等速電気泳動法により抽出された細胞質ＲＮＡ。スケールバーは２０μｍ。

注１） ＲＮＡ

ゲノムは細胞が持つ全遺伝情報であり、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）という生体高分子に４種類の塩基の配列として記録されている。ゲノムの中の遺伝情報が記録（コード）された領域が遺伝子である。遺伝子領域の情報は、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡ（リボ核酸）が合成（転写）されることで読み出される。

注２） １細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ法

１細胞中に含まれるＲＮＡを、ハイスループットＤＮＡシーケンサーを用いて解読（塩基配列決定）し、網羅的かつ定量的にその量や種類を決定する方法。

注３） 細胞周期

細胞は、分裂を繰り返して増殖するが、この細胞分裂のサイクルを細胞周期と呼ぶ。細胞周期は、間期とＭ期に分けられる。分裂が起こるＭ（Ｍｉｔｏｓｉｓ）期と、ＤＮＡの複製が起こるＳ（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）期、それぞれの間をつなぐＧ１（Ｇａｐ１）期、Ｇ２（Ｇａｐ２）期からなり、サイクルはＧ１→Ｓ→Ｇ２→Ｍ→Ｇ１→…の順に進む。

注４） ＲＮＡスプライシング

ゲノム上の遺伝子をメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写する過程の１つ。ゲノム上の遺伝子はエクソンとイントロンからなるが、ｍＲＮＡが形成される過程でイントロン配列が削除され、エクソン配列のみがｍＲＮＡとして残る。

＜論文情報＞

“ SINC-seq: correlation of transient gene expressions between nucleus and cytoplasm reflects single-cell physiology ” Mahmoud N. Abdelmoez, Kei Iida, Yusuke Oguchi, Hidekazu Nishikii, Ryuji Yokokawa, Hidetoshi Kotera, Sotaro Uemura, Juan G. Santiago, and Hirofumi Shintaku 10.1186/s13059-018-1446-9