志贺氏菌 ，革兰氏阴性肠侵袭性细菌，可以从吞噬体的胞液中逸出，并聚合宿主肌动蛋白细胞骨架，以逃避细胞内免疫反应，促进细胞内和细胞间移动 ^1,2。 尽管 在体外 ^3,4 肌动蛋白为基础的运动的理解，限制细菌传播 体内 的机制尚未完全定义。这是先天免疫和宿主防御的更完整的理解是至关重要的。

近年来septin家族，蛋白质的后生动物之间高度保守的家族，是鸟苷三磷酸（GTP）结合该组装成的杂寡聚复合物，并形成了与细胞膜和细胞骨架的 ^5,6 相关联的非极性丝蛋白。最近的工作已经发现感染的宿主细胞可预防 志贺氏菌 肌动蛋白基蠕动通过靶向autoph compartmentalizing菌AGY内“septin笼”，揭示了肌动蛋白抵消基于蠕动 ^7,8 的第一个细胞机制。调查的开阔场现在已成了“septin生物学和感染”。 Septin组装，诱发多种病原体（ 如李斯特菌 ^7,9,10， 分枝杆菌 ^7,8， 白色念珠菌 ^11）， 可能会成为在宿主防御 ^5,12 的一个关键问题。

自噬，一个高度保守的细胞内降解过程中，被认为是因为它能够提供胞浆菌溶酶体 ^13,14 能力，细胞自主免疫力的重要组成部分。然而，细菌噬 在体内 的作用，以限制或促进细菌复制仍了解 ^15,16 很差。斑马鱼（ 斑马鱼 ）已成为脊椎动物模型感染的研究，因为它是光学访问在幼虫期时的先天免疫系统已经是功能性 ^17,18。 最近的工作特点斑马鱼幼虫 S 的易感性 菌 ，一种范式细菌吞噬 ^15， 并采用了 志贺氏菌 -zebrafish感染模型，研究自噬的操作进行抗菌治疗 体内 ^19。

这份报告提供了新的工具和实验研究 学菌 相互作用与细胞自噬和细胞骨架。在第一步骤中，协议监测自噬细胞骨架相互作用所使用 志贺氏菌 感染的人上皮细胞系HeLa的说明。以评估的自噬细胞骨架相互作用的 体外志贺氏菌 感染过程中的作用，方法来操作的自噬和细胞骨架成分（使用的siRNA或药理学试剂）被提供。新的研究显示，通过使用 志贺氏菌 感染Ø˚F斑马鱼幼体，类似分析可应用于研究感染的细胞生物学 体内 。协议的准备和感染斑马鱼幼虫的详细，并评估 在体内 的宿主反应 志贺氏菌 感染，协议确定提供主机的生存和幼虫感染细菌的负担。方法监测的septin和自噬标记招募到 志贺氏菌 （使用固定的或活的斑马鱼幼体）和方法[用吗啉代寡核苷酸（在1-4细胞期胚胎中注射）或药理学试剂 的体内 测试这些过程中的作用（直接加入到斑马鱼的浴水）进行了讨论。本工作方案预计将提供深入了解所需感染的宿主细胞内反应的控制机制。

当使用组织培养细胞中监测自噬和细胞骨架 在体外 ， 在 部分1和2描述的方案可以适用于各种各样的组织培养物的细胞类型。此外，按照自噬（ 例如 ，Atg8结合/ LC3 +已经自噬体）和细胞骨架（ 例如 ，肌动蛋白尾，septin笼）在 志贺氏菌 在感染过程中实时使用实时成像动力学，组织培养细胞可短暂使用GFP-转染的， RFP-或CFP-标记的构建体如前所述 ^7,8。 以增加细胞感染 痢疾杆菌 的百分比（ 即 ，通常希望用于实时分析考虑到 志贺氏菌 可以在100侵入的HeLa细胞的5-30％：1 MOI），直接加 志贺氏菌 400微升（OD ₆₀₀ = 0.3 -0.6）细胞在2毫升的MEM（血清饥饿），并等待至少1.5小时，感染后有足够的细菌进入，从吞噬体，复制，AU逃生tophagy认可和septin隔离罩。或者，可以使用 志贺氏菌 M90T英辉菌株表达的粘附AfaE并在上皮细胞高得多的侵袭能力相比M90T应变 ^28。 值得注意的是，M90T英辉应变尚未 在体内 使用斑马鱼试验。 志贺氏菌 的菌落的平板，可以保持在4℃下2-3天，并用于多种实验。然而，随着时间的推移，已失去毒力质粒也可以吸收刚果红和出现 痢疾杆菌 的菌落，以保留了其毒性质粒。为此，我们建议在可能时使用新鲜的细菌种群。

当监测感染 体内 的细胞生物学，协议中的第3和第4使用野生型AB线的斑马鱼中描述。并监控 志贺氏菌 -leukocyte相互作用，转基因斑马鱼线可被使用， 例如，MPX：GFP 或 LYZ：DsRed 的视觉IZE中性粒细胞 ^19,29,30 或 MPEG1：mcherry 可视化的巨噬细胞 ^19,31。 为了形象地吞噬 体内 ，将GFP-LC3转基因斑马鱼线 ^19,24 可以按照3.8节所述使用。

扰乱吞噬 体内 ，有效吗啉代寡核苷酸的剂量具有实验是根据它的效率来抑制转录剪接或蛋白质翻译来进行评估。最好是进行滴定实验，并确认耗尽通过RT-PCR（用于拼接吗啉代寡核苷酸）或通过SDS-PAGE（对于平移吗啉代寡核苷酸 ^）32。 从斑马鱼胚胎或幼虫的RNA分离可使用异硫氰酸胍 – 酚 – 氯仿提取来进行。从斑马鱼幼虫（8〜15尾/管）中提取蛋白质，均质机械用200微升裂解液（1M，三，5M的NaCl，0.5M EDTA的杵，0.01％，辛基酚环氧乙烷condensate和蛋白酶抑制剂）。在19,000 XG在4℃下进行15分钟的离心管中，将上清液转移到新管中。加入Laemmli缓冲液并加热该样品在95℃下进行15分钟。溶胞产物可以贮存于-80℃，直到需要的，并且可以如在第2.3节中描述的通过Western印迹法来评估。

斑马鱼是 体内 药物应用的理想模型。分析使用吗啉代寡核苷酸可以补充建立药物操纵自噬（ 例如 ，雷帕霉素和巴弗洛霉素）。未感染和/或感染的幼虫可与雷帕霉素（1.5μM）或巴弗洛霉素（80 nm）的稀释中的E2和自噬通量可通过Western印迹法如在 ^25,33 中描述进行评估处理。自噬在操纵被感染的幼虫的​​感染和存活的结果的结果可以按照3.5节所述进行评估。

除了研究的宿主细胞决定因素， 在体外 和 体内的 协议可以被应用到评估所需的自噬识别细菌的决定因素，使用细菌突变菌株中差异由自噬的认可， 例如 ， 志贺氏ΔicsA（志贺氏菌 蛋白质ICSA募集的N- WASP然后ARP2 / 3肌动蛋白尾巴和septin笼形成;在缺席聆讯下，就没有肌动蛋白尾巴，没有septin笼）和 ShigellaΔicsB（志贺氏菌 通过避免细菌效应蛋白ICSB，从而防止细胞自噬机制，以 ICSA 招聘的自噬反应 ， 在其缺席可以有更多的septin笼，更多的自噬 ^）7,8。

志贺氏菌 是不是斑马鱼的天然病原体，并在37℃，最佳生长。然而，工作显示所需 志贺氏菌 侵袭的毒力因子，从吞噬液泡和复制在CY逃脱tosol可以表示和有功能在斑马鱼幼体在 ^28℃19。 28℃下是最常用的温度下，斑马鱼的饲养和标准温度，以确保正常的斑马鱼发育 ^23。 引人注目的是，在主要的致病事件导致志贺氏菌对人类（ 即 巨噬细胞的细胞死亡，浸润和增殖的上皮细胞内，细胞至细胞的传播，炎性破坏宿主上皮细胞）被忠实地复制在 志贺氏菌 感染的斑马鱼模型 ^19。

自噬和细胞骨架基因广泛表达，并具有广泛的生物学功能。小鼠的研究表明，基因敲除必需的自噬 ²⁶ 或septin基因 ^5顷 胚胎致死，并且很可能是一些这些基因也将是必需的斑马鱼发育（尽管这个问题可以通过以下事实斑马鱼有多个减小旁系同源基因 ^33）。 如果是的话，也有几种选择来克服这个问题，其中包括（i）使用的药理学试剂，以调节自噬和细胞骨架，（ⅱ）吗啉，可滴定向下，（ⅲ）敲除的基因可以被设计为仅在特定的细胞类型，和/或（iv）的基因涉及自噬识别来说不是必需的动物发展（ 例如 ，P62）可以靶向。

而斑马鱼是一种理想的模型系统来研究自噬和 志贺氏菌 感染过程中细胞骨架，分子工具目前所缺乏的。领域需要产生新的工具和感兴趣的蛋白质的驱动细胞特异性表达。击倒的自噬/细胞骨架基因的表达，新啉序列是必需的，并且（ 例如 ，TALEN，CRISPR / Cas9）也可以使用新的方法用于基因工程。在此期间，先前针对人或小鼠的研究中产生了多种工具可在斑马鱼同样的工作。

胞内菌 S.菌 产生的一种特殊的模式生物，以解决关键问题在生物，包括细菌的要被免疫系统 ^1,2 识别的能力。宿主细胞采用近年来septin家族限制 S 的运动 菌 ，并针对他们自噬，细胞免疫功能的自主 ^7,8 的重要组成部分。这些意见建议的新分子结构，研究自噬及其降解胞内细菌的能力。一个主要问题是，现在完全破译潜在的分子和细胞活动，并验证这些事件的细菌 感染 在 体内体外 分析使用相关的动物模型。为此，在斑马鱼已经被确立为 S 的分析的有价值的新主机 菌 感染 ^19。 细菌与宿主细胞之间的相互作用可以在高分辨率成像，并斑马鱼模型应该证明理解 志贺氏菌 感染的细胞生物 体内 有用的。斑马鱼幼体可以被用来研究细菌自噬在宿主防御中的作用，以及工作表明，自噬作用的扰动可能不利宿主存活响应于 志贺氏菌 感染 ¹⁹ 影响。

该意见从 志贺氏菌 的研究中产生的，利用组织培养细胞和 体内 利用斑马鱼幼虫可以提供理解宿主防御的基本进展septin笼养和自噬 在体外 。他们也可以提出旨在打击传染病的新战略。

本报告的一个重要目标是使 体外 分析的分子和细胞发生的事情（ 即 自噬，肌动蛋白尾巴，septin笼养）在耳鼻喉科的情况下细菌感染时 体内 愤怒的有机体，利用斑马鱼幼虫。如果不熟悉斑马鱼生物学和处理，可以指在深度协议进行适当的斑马鱼饲养 ²³ 和 在 斑马鱼感染 ^19,35 的 体内 分析。