Abstract
Objective
To establish a laboratory method for detection of
Mycobacterium tuberculosis
in sputum based on variable number tandem repeat (VNTR).
Methods
Mycobacterium tuberculosis
was tested by VNTR and fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (FQ-PCR) in 130 sputum samples from patients with pulmonary tuberculosis and 200 specimens from patients with other lung diseases. According to the amplification conditions and clinical detection needs, MTUB21, MUTB04, QUB18, QUB26, QUB11b, MIRU31, MIRU10 and MIRU26 were selected as test targets. The results of VNTR and FQ-PCR were compared with Lowenstein-Jensen culture and clinical diagnosis, and analyzed by chi-square test.
Results
With the results of L-J culture as the standard, the sensitivity and specificity of VNTR were 93.1% (108/116) and 97.7% (209/214), and those of FQ-PCR were 94.0% (109/116) and 96.7% (207/214), respectively; no significant difference was observed between two groups (
2
=0.352,
P
=0.569). Using the clinical diagnosis as the standard, the sensitivity and specificity of VNTR were 86.9% (113/130) and 100% (200/200), and those of FQ-PCR were 87.7% (114/130) and 99.0% (198/200), respectively; the difference was not statistically significant (
2
=0.030,
P
=0.862). In 113 VNTR positive samples, the molecular codes differed from each other in 98.2% samples (111/113); only 2 samples had identical code (5-4-6-8-5-5-3-8).
Conclusion
The study suggests that VNTR provides a promising method for diagnosis of clinical tuberculosis.
Keywords:
Mycobacterium tuberculosis
/isolation & purification
, Tuberculosis, pulmonary/diagnosis, Sputum/microbiology,
Mycobacterium tuberculosis
/genetics
, Genotype, Tandem repeat sequences
结核病(tuberculosis)作为全球最致命的传染病之一长期威胁着人类的健康，在2000年至2013年期间，全球通过结核防控工作的有效实施，已经避免了约3700万人的死亡。而对结核病的治疗和防控的关键在于结核病的实验室快速诊断
。结核分枝杆菌培养仍是目前诊断结核病的金标准。但由于结核分枝杆菌生长缓慢，需要较长的检测时间是以结核分枝杆菌培养为基础的诊断方法的不足之处。痰涂片镜检作为一种传统方法已使用多年，但因低灵敏度削弱了其在临床上的实用价值
。以核酸扩增为基础的分子生物学诊断技术应运而生，因其高效性和高灵敏度的特点正在临床上得到越来越广泛的应用。但由于分子扩增的高效性和实验中的交叉污染易导致结果的假阳性
，因此，区分分子生物学诊断结果的真假阳性显得尤为重要。
在结核分枝杆菌的非编码区中存在一些DNA片段，他们以40~100 bp的单元为串联重复序列。不同的结核分枝杆菌可以具有不同的重复数。这些随机重复序列被称为结核分枝杆菌散在重复单元—可变数目串联重复序列(mycobacterial interspersed repetitive units-variable number of tandem repeats，MIRU-VNTR)
。长期以来MIRU-VNTR作为流行病分析的一种手段，尤其MIRU-VNTR的24位点分型和15位点分型应用最为广泛。目前大多采用的方法是先将结核分枝杆菌分离培养，再用于结核分枝杆菌的基因分型分析
，这样耗时多，不利于临床的及时诊断。本研究直接对痰液样本进行MIRU-VNTR分析，以缩短检测时间和提高检测准确度。
选择130例2015年1月至2015年5月就诊于上海市肺科医院的肺结核患者为结核组，其中男性62例，女性68例，年龄15~72岁，平均年龄(44±4) 岁，诊断标准参照文献
；分别收集结核组患者痰液标本130例。选择200例2015年1月至2015年5月就诊于上海市肺科医院的其他肺部疾病患者为非结核组，其中男性101例，女性99例，年龄14~81岁，平均年龄(48±6) 岁；分别收集非结核组患者痰液标本200例。所有患者皆为人类免疫缺陷病毒阴性，所有患者皆签署知情同意书。
患者清晨漱口后，咳出深部痰液于一次性痰杯中并加盖送检，应尽量避免唾液的混入，以免影响检测结果。采用N-乙酰-N-半胱氨酸-氢氧化钠法对痰液进行前处理，沉淀后用生理盐水重悬后作为标本，用于MIRU-VNTR分析、荧光定量聚合酶链反应(fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，FQ-PCR)、罗氏培养以及备用。备用标本用于MIRU-VNTR分析与FQ-PCR不一致结果的基因测序。
H37RV是结核分枝杆菌标准菌株。本研究以超声法处理痰液标本，获得标本的基因组DNA。以H37RV菌株为阳性对照，以无菌水为阴性对照，参照文献处理痰液标本
，获得的基因组DNA用于FQ-PCR检测。样本采用结核分枝杆菌FQ-PCR体外试剂盒(德国凯杰生物工程有限公司)在LightCycler480(德国罗氏生物技术有限公司)上进行测定(参照试剂盒说明书)。
以文献报道和前期预实验结果为基础，选取分辨率较高、变异度较大的MIRU-VNTR作为候选位点
；同时为了简化实验操作，筛选并确定了扩增条件一致的八个MIRU-VNTR位点作为检测位点。MIRU-VNTR位点及引物序列参照文献
，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，见
。
表1
MIRU-VNTR位点及其引物序列
Table 1
Primer sequences and repeat unit sizes of the MIRU-VNTR loci
侧翼序列(bp)
引物序列(5’-3’)
MTUB21
正: AGATCCCAGTTGTCGTCGTC, 反: CAACATCGCCTGGTTCTGTA
MTUB04
正: GTCCAGGTTGCAAGAGATGG, 反GGCATCCTCAACAACGGTAG
QUB18
正: ATCGTCAGCTGCGGAATAGT, 反: AATACCGGGGATATCGGTTC
QUB26
正: AACGCTCAGCTGTCGGAT, 反: GGCCAGGTCCTTCCCGAT
2163b
QUB11b
正: CGTAAGGGGGATGCGGGAAATAGG, 反: CGAAGTGAATGGTGGCAT
MIRU31
正: CGTCGAAGAGAGCCTCATCAATCAT, 反: AACCTGCTGACCGATGGCAATATC
MIRU10
正: ACCGTCTTATCGGACTGCACTATCAA, 反: CACCTTGGTGATCAGCTACCTCGAT
MIRU26
正: GCGGATAGGTCTACCGTCGAAATC, 反: TCCGGGTCATACAGCATGATCA
1,
*
