忆 张
四川大学华西医院公共实验技术中心（成都 610041）,
Research Core Facility of West China Hospital, Sichuan University, Chengdu Sichuan, 610041, P.R.China
利 周
四川大学华西医院公共实验技术中心（成都 610041）,
Research Core Facility of West China Hospital, Sichuan University, Chengdu Sichuan, 610041, P.R.China
林巧 唐
四川大学华西医院公共实验技术中心（成都 610041）,
Research Core Facility of West China Hospital, Sichuan University, Chengdu Sichuan, 610041, P.R.China
廷武 秦
四川大学华西医院公共实验技术中心（成都 610041）,
Research Core Facility of West China Hospital, Sichuan University, Chengdu Sichuan, 610041, P.R.China
良菊 宁
四川大学华西医院公共实验技术中心（成都 610041）,
Research Core Facility of West China Hospital, Sichuan University, Chengdu Sichuan, 610041, P.R.China
四川大学华西医院公共实验技术中心（成都 610041）,
Research Core Facility of West China Hospital, Sichuan University, Chengdu Sichuan, 610041, P.R.China
四川大学华西医院干细胞与组织工程研究室（成都 610041）,
Laboratory of Stem Cell and Tissue Engineering, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu Sichuan, 610041, P.R.China
宁良菊，Email：
为明确肌腱切片中胶原纤维束的完整性，需要进行组织学观察。然而，传统 HE、Masson 及免疫学染色方法存在操作繁琐、试剂与时间成本高、准确度差、无法观察到组分分布细节等缺点。我们结合前期制片经验，摸索出一种用于肌腱胶原纤维束及周围腱内膜组分分布形态学观察的快速组织学制片法，即冰冻切片制样后先于 65℃ 烘烤 10 min 再行 Masson 染色。该方法不仅将整个染色实验周期从传统石蜡制样的 2 d 缩短至 30 min 以内，还能清晰显示胶原纤维束与周围腱内膜分布。报告如下。
1. 材料与方法
1.1. 主要试剂及仪器
过碘酸雪夫（Priodic acid-Shiff，PAS）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；网状纤维染色试剂盒、Masson 染色试剂盒（珠海贝索生物技术有限公司）；Ⅲ型胶原抗体（Abcam 公司，英国）；OCT 冰冻切片包埋剂（Tissue-Tek 公司，美国）。冰冻切片机（Leica 公司，德国）；烘箱（Binder 公司，德国）；荧光显微镜（ZEISS 公司，德国）。
1.2. 实验方法
1.2.1. 冰冻切片制备及观察
将市售新鲜猪趾浅屈肌腱横切为 1 cm 长度，OCT 包埋后，使用冰冻切片机里预冷的冷冻锤对组织进行快速降温包埋，于–20℃ 行 6 μm 厚切片。大体观察切片完整性后，取部分切片置于 10% 中性甲醛中固定 5 min，苏木素染色 5 min，分化促蓝后，伊红染色 1 min，晾干封片。显微镜下观察组织完整性与冰晶形成情况。
1.2.2. 实验分组及方法
根据染色方法不同，将 1.2.1 中制备的切片随机分为 5 组。A 组行 PAS 染色，B 组行 Masson 染色，C 组行网状纤维染色，D 组分别行Ⅲ型胶原免疫组织化学和免疫荧光染色，E 组切片先于烘箱经 65℃ 烘烤 10 min 后再行 Masson 染色。显微镜下观察肌腱胶原纤维束与周围腱内膜组分分布情况。
2. 结果
2.1. 冰冻切片观察
大体观察切片连续均匀，无肉眼可见空洞。HE 染色见组织整体结构完整清晰，无冰晶空隙形成，但无法观察到胶原纤维束与周围腱内膜组分分布情况。见
。
2.2. 不同方法染色后观察
A 组：组织整体呈红色，胶原纤维束与周围腱内膜显色无明显差异，无法清楚辨认组分分布。B 组：组织整体被苯胺蓝染色，呈蓝色，无法辨认组分分布。C 组：胶原纤维束与周围腱内膜均呈褐色显色，无法清楚辨认组分分布。D 组：周围腱内膜呈Ⅲ型胶原阳性表达，组分差异化染色，但对比度较差。E 组：周围腱内膜被苯胺蓝染色，呈蓝色，胶原纤维束被丽春红染色，呈红色，组分清晰可见。见
。
3. 讨论
Masson 染色是病理技术中常规及广泛使用的制片方法，在组织形态学评价方面具有重要作用
[
4
-
9
]
，目前主要用于区别胶原纤维和肌纤维，但常需要与石蜡切片配合操作
[
10
-
12
]
，这与 Masson 染色的染色原理有关。Masson 染色是根据组织中胶原纤维与肌纤维不同的渗透性能，选择分子大小不同的阴离子染料进行差异化染色。而石蜡组织经充分固定、脱水、浸蜡后，将胶原纤维和肌纤维的渗透性能的差异放大，所以石蜡切片行 Masson 染色更容易。但正是由于石蜡制片经历的以上步骤，会导致肌腱组织发生收缩，从而影响对胶原纤维束直径的计算
[
13
-
14
]
。同时，肌腱属于致密结缔组织，完整肌腱石蜡包埋后硬度极高，切片时难以完整保留组织。所以我们提出了一种既不会对组织产生收缩作用，又能保证切片完整性的冰冻切片方法。传统冰冻切片在制片过程中往往因为冰晶形成破坏了组织的形态结构，所以在进行 OCT 包埋时，我们采用事先预冷的冷冻锤对包埋组织进行快速降温，让其在较短时间内越过冰晶易形成的温度，保护了冰冻切片的微观完整性
[
15
-
17
]
。
为探讨这种组织学制片方法能否用于肌腱胶原纤维束及周围腱内膜组分分布形态学观察，我们对目前常用的几种染色方法进行了比较。A 组是常用的糖蛋白染色法，考虑到基底膜组织中含有较为丰富的糖蛋白，该方法可以使周围腱内膜单独显色
[
18
-
20
]
。但肌腱组织较为特殊，为了保持其足够的力学强度，构成胶原纤维束的肌腱纤维之间也含有大量的糖蛋白
[
21
-
22
]
，所以 PAS 染色后组织整体呈阳性显色。B 组直接进行 Masson 染色，但不管是胶原纤维束还是周围腱内膜，其本质都是胶原纤维，所以整体呈蓝色显色。胶原纤维束主要由Ⅰ型胶原构成，周围腱内膜由Ⅰ型胶原与少量Ⅲ型胶原共同构成，同时Ⅲ型胶原又是构成网状纤维的主要成分
[
23
-
25
]
，所以 C 组选用网状纤维染色法来显示周围腱内膜。利用网状纤维具有的嗜银特性，将银溶液中的银还原为不溶性的黑色金属银沉淀来单独显色
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26
-
27
]
。其嗜银原理本质是氨银络合物染料与网状纤维表层的糖蛋白发生特异性结合，但胶原纤维束中也含有大量糖蛋白，导致肌腱组织整体出现嗜银结果，胶原纤维束与周围腱内膜差异化染色不明显，并且嗜银染色大多是在石蜡切片后进行，流程极为繁琐，染色条件要求苛刻
[
28
]
。D 组直接利用Ⅲ型胶原抗体对周围腱内膜进行免疫特异性结合，该方法能准确显示肌腱组织中周围腱内膜的分布情况，但两组分对比度较差。因为肌腱组织中除Ⅰ型胶原以外，其余类型胶原含量不到胶原总量的 2%～3%
[
29
]
，所以免疫组织化学染色显色较弱，只能通过荧光拍照和图像处理技术放大荧光信号后才有一定对比度。同时，该方法试剂成本较高，抗体孵育过程耗时长。
E 组跟 B 组相比，同样是采用 Masson 染色方法，但 E 组在染色前对冰冻切片进行了高温烘烤处理，达到胶原纤维束被小分子丽春红染料显红色，周围腱内膜被大分子苯胺蓝染料显蓝色，清楚表征肌腱组织胶原纤维束与周围腱内膜组分分布的目的。E 组方法能将同是胶原纤维构成的两组分进行差异化染色，这与胶原纤维束与周围腱内膜存在结构差异有关。胶原纤维束因提供强大抗拉功能，其绝大多数胶原纤维呈有序的紧密平行排列；而周围腱内膜起支持和营养作用，其纤维呈明显的疏松网状分布
[
26
]
。肌腱冰冻切片在进行高温烘烤时，胶原纤维束与周围腱内膜出现不同程度收缩，从而导致 Masson 染色时两种组分对丽春红与苯胺蓝两种染料分子出现较大差异的组织渗透性。但使用 E 组方法时需注意把握冰冻切片的烘烤程度，烘烤时间不够，两组分组织渗透压差异不大，小分子丽春红染料难以附着；烘烤时间太长，组织整体收缩过度，大分子苯胺蓝染料难以附着。
综上述，本实验将新鲜猪趾浅屈肌腱直接通过冰冻切片、65℃ 烘烤 10 min 后 Masson 染色，成功对组织中胶原纤维束与周围腱内膜进行快速差异化染色。在制备肌腱片状支架材料时，可用此方法观察肌腱组织学形态，以指导保护材料的生物力学性能。
作者贡献：张忆负责实验设计、本文染色方法摸索与图像采集、文章撰写；周利负责部分实验实施（PAS、Masson、网状纤维染色）及图像采集；唐林巧负责部分实验实施（免疫组织化学染色、免疫荧光染色）及图像采集；秦廷武负责科研设计，参与文章修改；宁良菊负责科研设计及文章修改。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。经费支持没有影响文章观点及其报道。
Funding Statement
国家自然科学基金资助项目（31600783、31870968）；四川省重点研发项目（2018SZ0044、2018SZ0052）
National Natural Science Foundation of China (31600783, 31870968); Science and Technology Plan of Sichuan Province (2018SZ0044, 2018SZ0052)
References
1.
Liu Y, Ramanath HS, Wang DA Tendon tissue engineering using scaffold enhancing strategies.
Trends Biotechnol.
2008;
26
(4):201–209. doi: 10.1016/j.tibtech.2008.01.003.
[
PubMed
] [
CrossRef
]
[
Google Scholar
]
2.
Kannus P Structure of the tendon connective tissue.
Scand J Med Sci Sports.
2000;
10
(6):312–320. doi: 10.1034/j.1600-0838.2000.010006312.x.
[
PubMed
] [
CrossRef
]
[
Google Scholar
]
3.
Qin TW, Chen Q, Sun YL, et al Mechanical characteristics of native tendon slices for tissue engineering scaffold.
J Biomed Mater Res B Appl Biomater.
2012;
100B
(3):752–758. doi: 10.1002/jbm.b.v100b.3.
[
PMC free article
]
[
PubMed
] [
CrossRef
]
[
Google Scholar
]
4.
顾怡瑾, 陆新元, 付华辉, 等 Masson 染色在辅助诊断肝纤维化中应用
临床与实验病理学杂志
2012;
28
(1):101–102. doi: 10.3969/j.issn.1001-7399.2012.01.032.
[
CrossRef
]
[
Google Scholar
]
5.
杨小荣, 刘芳, 汪芳, 等 Masson 染色法在周围神经损伤中的应用
诊断病理学杂志
2012;
19
(6):473–474. doi: 10.3969/j.issn.1007-8096.2012.06.027.
[
CrossRef
]
[
Google Scholar
]
6.
Huang YZ, Wang JJ, Huang YC, et al Organic composite-mediated surface coating of human acellular bone matrix with strontium.
Mater Sci Eng C Mater Biol Appl.
2017;
84
:12–20.
[
PubMed
]
[
Google Scholar
]
7.
Ni P, Ding Q, Fan M, et al Injectable thermosensitive PEG-PCL-PEG hydrogel/acellular bone matrix composite for bone regeneration in cranial defects.
Biomaterials.
2014;
35
(1):236–248. doi: 10.1016/j.biomaterials.2013.10.016.
[
PubMed
] [
CrossRef
]
[
Google Scholar
]
8.
Wang ZL, Wu SZ, Li ZF, et al Comparison of small intestinal submucosa and polypropylene mesh for abdominal wall defect repair.
J Biomater Sci Polym Ed.
2018;
29
(6):1–20.
[
PubMed
]
[
Google Scholar
]
9.
He SK, Guo JH, Wang ZL, et al Efficacy and safety of small intestinal submucosa in dural defect repair in a canine model.
Mater Sci Eng C Mater Biol Appl.
2017;
73
:267–274. doi: 10.1016/j.msec.2016.12.077.
[
PubMed
] [
CrossRef
]
[
Google Scholar
]
10.
韩天龙, 王敏, 红敏, 等 Masson 三色染色与 HE 染色在豚鼠牙齿组织石蜡切片中的比较研究及应用
中国畜牧兽医
2011;
38
(3):55–57.
[
Google Scholar
]
11.
王珏, 朱礼国, 唐幕湘, 等 改良 Masson 三色染色法在胶原纤维中的应用
郧阳医学院学报
2006;
25
(1):44. doi: 10.3969/j.issn.1006-9674.2006.01.020.
[
CrossRef
]
[
Google Scholar
]
12.
张哲, 王伟, 商建峰, 等 胶原纤维特殊染色法在心肌纤维化诊断中的应用比较
诊断病理学杂志
2016;
23
(8):578–580. doi: 10.3969/j.issn.1007-8096.2016.08.005.
[
CrossRef
]
[
Google Scholar
]
13.
蔡新华, 郭志坤, 霍殿样 石蜡包埋对兔肝、肾组织块的收缩影响
解剖科学进展
2000;
6
(4):380–381. doi: 10.3969/j.issn.1006-2947.2000.04.030.
[
CrossRef
]
[
Google Scholar
]
14.
蔡新华, 郭志坤 石蜡包埋对心、肺和脾组织的收缩影响
解剖学杂志
2002;
25
(2):198–199. doi: 10.3969/j.issn.1001-1633.2002.02.025.
[
CrossRef
]
[
Google Scholar
]
15.
王华, 罗殿中. 术中冰冻切片制片的规范化操作与常见问题原因分析. 2011 年全国西安病理技术学术会议暨全军病理技术学术会议论文集. 西安: 解放军医学科学技术委员会, 2011.
16.
包翠芬, 刘霞, 穆长征, 等 比较三种防冰晶法对切片保存效果的影响
中国组织化学与细胞化学杂志
2007;
16
(1):122–123. doi: 10.3870/j.issn.1004-1850.2007.01.023.
[
CrossRef
]
[
Google Scholar
]
17.
杨秀静, 滕孝静 冰冻切片技术经验探讨
临床和实验医学杂志
2014;
13
(23):2002–2004. doi: 10.3969/j.issn.1671-4695.2014.23.030.
[
CrossRef
]
[
Google Scholar
]
18.
王珏, 朱礼国, 张健, 等 肾脏 PAS 染色法的探讨
实用医技杂志
2006;
13
(22):4097. doi: 10.3969/j.issn.1671-5098.2006.22.167.
[
CrossRef
]
[
Google Scholar
]
19.
钟妮娜, 耿毅, 彭西 PAS 染色技术的改进
解剖学杂志
2005;
28
(6):723–724. doi: 10.3969/j.issn.1001-1633.2005.06.041.
[
CrossRef
]
[
Google Scholar
]
20.
胡沛臻, 马福成, 张传山, 等 微波网状纤维染色法在病理诊断中的应用
诊断病理学杂志
2002;
9
(4):249. doi: 10.3969/j.issn.1007-8096.2002.04.028.
[
CrossRef
]
[
Google Scholar
]
21.
李萍萍, 葛青. 软骨寡聚基质蛋白 (COMP) 对 B 淋巴细胞发育及功能的影响.中国细胞生物学学会全国学术大会论文集. 武汉: 中国细胞生物学学会, 2013.
22.
魏壮, 崔树森, 张巨, 等 预防肌腱粘连的研究与进展
吉林大学学报
2001;
27
(2):218–220.
[
Google Scholar
]
23.
Franchi M, Trirè A, Quaranta M, et al Collagen structure of tendon relates to function.
The Scientific World Journal.
2017;
7
:404–420.
[
PMC free article
]
[
PubMed
]
[
Google Scholar
]
25.
蔡新华, 郭志坤, 毛会丽, 等 大鼠心肌组织中网状纤维组织学构筑及增龄变化
解剖学报
2009;
40
(1):127–129. doi: 10.3969/j.issn.0529-1356.2009.01.026.
[
CrossRef
]
[
Google Scholar
]
26.
廖大清, 马玉琼, 陈思秀 一种显示网状纤维的方法
四川解剖学杂志
2001;
9
(2):92–93. doi: 10.3969/j.issn.1005-1457.2001.02.037.
[
CrossRef
]
[
Google Scholar
]
27.
韩庆伟, 张云 特殊染色网状纤维在病理诊断中的应用
实用医技杂志
2007;
14
(11):1420. doi: 10.3969/j.issn.1671-5098.2007.11.036.
[
CrossRef
]
[
Google Scholar
]
28.
田玉旺, 李琳, 朱红艳, 等 提高网状纤维染色质量的技术探讨
中国组织化学与细胞学杂志
2012;
21
(3):316–318.
[
Google Scholar
]
